孫丹，王淑坤，丁康，劉美逸，蔣欣，陳燕春，周風華*

(1濰坊醫(yī)學院病理學教研室，2.濰坊醫(yī)學院生物科學與技術學院，3.濰坊醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，濰坊，261053)

肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是脊髓、腦干運動神經(jīng)元進行性變性所致的慢性神經(jīng)退行性疾病。運動神經(jīng)元退化會導致肌肉萎縮和進行性麻痹，病人最終因呼吸肌麻痹導致呼吸衰竭而死亡[1]。microRNA（miRNA）是一類小的內(nèi)源性調(diào)控RNA，它能夠在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控目的基因的表達。miRNA-132在神經(jīng)元中表達豐富，在神經(jīng)退行性疾病中可通過直接或間接調(diào)控其目的基因發(fā)揮作用[2]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員，中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量豐富，在維持正常神經(jīng)元發(fā)育、存活及神經(jīng)可塑性中起重要作用[3]。miRNA-132、BDNF在ALS中的作用尚不明確。本實驗選取ALS轉(zhuǎn)基因鼠，通過原位雜交、qRT-PCR、Western blot及免疫熒光技術檢測miRNA-132、BDNF在ALS轉(zhuǎn)基因鼠脊髓組織中的表達變化，探討miRNA-132、BDNF在ALS發(fā)病中的作用及意義。

材料與方法

1 實驗動物準備

實驗用SOD1-G93A ALS轉(zhuǎn)基因小鼠均購自美國Jackson實驗室。小鼠飼養(yǎng)、合籠及30d小鼠DNA鑒定均按吳欣等[4]方法進行。取成年ALS鼠95d、108d和122d的脊髓組織，以同窩野生型鼠作為對照，部分組織4%多聚甲醛灌注固定，制成冰凍切片（厚度7μm）用于原位雜交及免疫熒光檢測，部分組織液氮凍存用于分子生物學實驗。

2 qRT-PCR

用Trizol一步法提取ALS轉(zhuǎn)基因鼠脊髓組織RNA并逆轉(zhuǎn)錄[4]，miRNA-134、BDNF逆轉(zhuǎn)錄及擴增反應參照之前的程序進行[5]。miRNA-134、BDNF的檢測分別以U6、β-actin作為內(nèi)對照。miRNA-134和U6反轉(zhuǎn)錄引物分別為：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGGCGA-3’和 5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。BDNF 上游引物 5’-TCCACGGACAAGGCAACTT-3’， 下 游 引 物 5’-TCGTCGTCAGACCTCTCGAA-3’；β-actin 上 游 引 物5’-CGTTGACATAAGTAAAGACC-3’，下游引物 3’-ACAGTCCGCCTAGAAGCAC-5’。

3 原位雜交

脊髓組織冰凍切片行原位雜交檢測，具體實驗步驟參照之前進行[6]。地高辛標記miRNA-132探針購自丹麥Exqion公司，使用濃度為1：100。

4 Western blot檢測

用含1mmol/L PMSF的RIPA裂解液冰上裂解脊髓組織30min，4℃離心15min，并測蛋白濃度。配制12%的SDS-DAGE 凝膠，每孔上樣30μl，恒壓80V，40min，再恒壓120V ，70min，之后PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，恒流300mA，110min。5%脫脂奶粉封閉抗原2h，之后孵育一抗 BDNF（1∶500，Arigo）、GAPDH（1∶2000，Proteintech Group），冰箱 4℃ 過夜。次日孵育羊抗兔和羊抗小鼠HRP 酶標二抗（1∶5000）2h，滴加ECL后暗室曝光。應用Image J軟件分析Western blot條帶光密度，以BDNF與GAPDH條帶光密度值代表BDNF相對水平。

5 免疫熒光

參照之前的方法[6]將制好的脊髓冰凍切片進行免疫熒光染色，滴加兔抗 BDNF（1∶100）、鼠抗β-tubulin Ⅲ（1∶200），4℃ 孵育過夜。滴加 Cy3 標記的羊抗兔（1∶200）和 Alexafluor 488 標記的羊抗鼠（1∶200）熒光二抗，滴加 Hoechst（1∶800），熒光顯微鏡下觀察 BDNF 及 β-tubulin Ⅲ 表達情況。

6 統(tǒng)計學分析

采用Prism 5.01 軟件 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) 進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準（ˉx±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 miRNA-132在ALS轉(zhuǎn)基因鼠脊髓組織表達降低

qRT-PCR 檢測顯示，與WT鼠相比，在ALS發(fā)病的早、中、晚期miRNA-132在ALS轉(zhuǎn)基因鼠脊髓組織表達下調(diào)（圖1A）；原位雜交結果顯示，miRNA-132陽性表達呈紫藍色顆粒，在脊髓前角、脊髓后角均可查見陽性細胞，與WT鼠相比，脊髓前角中miRNA-132陽性信號表達下降（圖1B）。

2 BDNF在ALS轉(zhuǎn)基因鼠脊髓組織表達增加

qRT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與WT鼠相比，ALS轉(zhuǎn)基因鼠脊髓組織中BDNF在mRNA及蛋白水平均顯著上調(diào)（圖2，圖3）；免疫熒光染色顯示，ALS轉(zhuǎn)基因鼠和WT鼠脊髓前角中均檢測到BDNF免疫陽性細胞，且與β-tubulin Ⅲ標記的神經(jīng)元共表達。與WT鼠對比，ALS鼠脊髓前角運動神經(jīng)元中BDNF免疫陽性反應顯著升高增強（圖4)。

討 論

圖1 ALS鼠中miRNA-132 mRNA表達降低。A，qRT-PCR檢測的統(tǒng)計學分析（與WT比較：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01; n=3）；B，原位雜交組織化學檢測（比例尺，50um）Fig. 1 Expression of miRNA-132 mRNA in ALS mice. A, statistical analysis for qRT-PCR detection results (compared with WT∶ *, 0.01＜P＜0.05; **,P＜0.01; n=3); B, in situ hybridization histochemical examination (scale bar, 50um)

圖2 ALS鼠中BDNF mRNA表達的 qRT-PCR檢測。與WT比較：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；n=3Fig. 2 qRT-PCR detection for expression of BDNF mRNA in ALS mice.Compared with WT∶ *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01; n=3

ALS是一種進行性和致命的神經(jīng)退行性疾病[7]，其發(fā)病機制包括谷氨酸興奮性毒性、氧化應激、線粒體功能障礙、炎癥及細胞凋亡等，但運動神經(jīng)元進行性變性死亡的分子機制尚不清楚[8]。miRNA能在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控目的基因的表達，在神經(jīng)系統(tǒng)中存在一組特有的miRNA參與中樞發(fā)育、神經(jīng)元分化和突觸塑形的過程。近年來發(fā)現(xiàn)，miRNAs與阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer’s disease，AD）、帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）、亨廷頓?。℉untington’s disease，HD）等多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展有關[9,10]。miRNA-132在一些神經(jīng)發(fā)育異常、精神性疾病及神經(jīng)變性疾病中表達異常[11,12]。本實驗通過原位雜交和qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，與WT鼠相比，miRNA-132陽性細胞主要定位于脊髓前角，在ALS鼠脊髓組織表達量明顯下調(diào)，表明miRNA-132在ALS發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員，對神經(jīng)元的維持和存活、保持突觸完整性和突觸可塑性起重要作用[13]。研究表明，BDNF對AD、HD等神經(jīng)退行性疾病神經(jīng)元具有保護作用[14,15]，但在ALS發(fā)病過程中作用尚不明確。本實驗通過qRT-PCR、Western blot等技術檢測發(fā)現(xiàn)，ALS鼠脊髓組織BDNF表達明顯上調(diào)；通過免疫熒光雙標記發(fā)現(xiàn)BDNF陽性細胞與β-tubulin Ⅲ標記的神經(jīng)元共表達，其在ALS鼠脊髓前角神經(jīng)元中的免疫陽性反應明顯增強。我們認為BDNF表達增加可能是機體對神經(jīng)元退變的一種保護性反應。在多種疾病中發(fā)現(xiàn)[16]，miRNA-132能夠靶向調(diào)控BDNF發(fā)揮作用，在ALS發(fā)病過程中miRNA-132是否通過靶向調(diào)控BDNF發(fā)揮作用尚不清楚，后期我們將通過細胞實驗進一步驗證miRNA-132、BDNF在ALS發(fā)病的作用及分子機制，為探討ALS的發(fā)病機制奠定基礎。

圖3 ALS鼠中BDNF水平的Western blot檢測。A，Western blot代表性結果；B，BDNF表達水平的統(tǒng)計學分析（與WT比較：0.01＜P＜0.05；n=3）Fig. 3 Western blot detection for expression level of BDNF protein in ALS mice. A, representative resulta of Western blot; B, statistical analysis for BDNF expression level (compared with WT∶ *, 0.01＜P＜0.05; n=3)

圖4 免疫熒光雙標記檢測顯示122d齡ALS鼠中BDNF表達增強。比例尺，50umFig. 4 Detection for BDNF expression in 122-day-old ALS mice by immunofluorescence double labeling. Scale bar, 50um