馬赫，張葆荔，劉寶英，馬斌芳，李臻*

（1第四軍醫(yī)大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，西安 710032；2上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 201210）

附睪是哺乳動物精子成熟、獲得受精能力、儲存和保護的重要器官[1]。附睪管腔的離子濃度受到多種通道蛋白和離子泵的精細調(diào)控，其中鈣離子的濃度遠低于血液鈣離子濃度，且管腔內(nèi)鈣離子濃度沿頭體尾部呈梯度降低[2]。低鈣環(huán)境可以維持精子靜息狀態(tài)，防止精子提前激活，而附睪管腔鈣離子濃度異常升高將導(dǎo)致精子過早活化，精子運動功能降低，甚至雄性生育缺陷或不育[3]，然而附睪管腔鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)機制仍未被充分闡明。

基質(zhì)Gla蛋白（matrix Gla protein，MGP）是一種分子量為12 kDa的分泌性蛋白，含有5個γ谷氨酰基殘基[4]。作為維生素K2（vitamin K2, VK2）依賴的異位鈣化抑制因子，MGP需要在VK2充足的情況下被γ-谷氨酰基羧化酶（γ-glutamyl carboxylase，GGCX）羧化激活從而發(fā)揮作用。被羧化激活的MGP可結(jié)合鈣離子或鈣晶體，防止組織局部游離鈣濃度過高和鈣鹽沉積[5]。以往對VK2依賴的MGP對鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的研究大多集中在血管鈣化和慢性腎病上，而這種重要的鈣調(diào)控機制在男性生殖系統(tǒng)，尤其是需要維持低鈣環(huán)境的附睪中的作用仍未被探究。本文采用實時定量PCR和免疫熒光染色技術(shù)，檢測MGP在大鼠附睪發(fā)育過程中的表達及定位，為今后深入探究其在維持附睪管腔鈣穩(wěn)態(tài)的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

材料與方法

1 組織材料

健康雄性SD大鼠，出生后6d、10d、3w、5w、7w、8w、10w及12w各3只，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司。3%戊巴比妥鈉以50 mg/kg體重腹腔麻醉，取左側(cè)附睪置于4%多聚甲醛固定過夜，梯度蔗糖脫水后Tissue-Tek OCT包埋，冰凍切片（10μm）用于免疫熒光染色。取右側(cè)附睪用于提取RNA進行實時定量PCR分析。

2 主要試劑

RNA提取液Trizol Reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒qPCR RT Master Mix以及SYBR Green PCR Master Mix均購自德國Qiagen公司；大鼠內(nèi)參18S購自生工生物工程（上海）股份有限責(zé)任公司；兔抗MGP多克隆抗體（ab192396）購自英國Abcam公司，雞抗B1-VATPase多克隆抗體由Sylvie Breton教授饋贈，Cy3標(biāo)記山羊抗兔，F(xiàn)ITC標(biāo)記驢抗雞熒光二抗均購自美國Jackson公司；含DAPI封片劑購自英國Abcam公司；組織包埋劑Tissue-Tek OCT購自美國Sakura公司。

3 實時定量PCR

新鮮附睪組織100mg，凍存于液氮中，冰上研磨成粉末后Trizol法提總RNA，在10μl 體系中加入0.8μg RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以 37°C 15min、85°C 5s反應(yīng)條件合成cDNA。實時定量PCR采用20μl體系，MGP上下游引物分別為：5’-CAGCCCTGTGCTATGAATC-3’；5’-AAGGTGTTGGCATTTCTCC-3’。反應(yīng)條件為 95°C 30s；95°C 5s，60°C 30s，40 個循環(huán)。每次擴增均設(shè)目的基因組和內(nèi)參基因組及空白對照組，根據(jù)測得CT值，以大鼠18S為內(nèi)參，采用ΔCt法計算MGP mRNA的相對表達量。

4 免疫熒光染色

組織冰凍切片在PBS中水化后，1% SDS/PBS孵育4min，1% BSA室溫封閉2h，兔抗MGP多克隆抗體（1∶100）4°C孵育過夜，Cy3標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶400）室溫孵育2h，雞抗B1- VATPase多克隆抗體（1∶500）室溫孵育2h，F(xiàn)ITC標(biāo)記驢抗雞二抗（1∶60）室溫孵育2h，封片劑（含DAPI）封片。用一抗稀釋液代替一抗作為陰性對照。封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相。

結(jié) 果

1 MGP mRNA在大鼠附睪不同發(fā)育階段的表達

對大鼠附睪發(fā)育過程各個關(guān)鍵時間節(jié)點提取的mRNA進行實時定量PCR檢測，結(jié)果顯示在大鼠附睪發(fā)育不同階段均有MGP mRNA的表達，在附睪發(fā)育分化初始階段（6d）表達量較低，6d至3w表達量逐漸升高并于3w達到高峰，隨后3～8w MGP mRNA的表達量逐漸降低，在大鼠成年后（10～12w）其表達量逐漸升高并穩(wěn)定在較高水平（圖1）。

圖1 MGP mRNA在大鼠附睪不同發(fā)育階段表達變化的實時定量PCR檢測Fig.1 Detection for MGP mRNA expression in the rat epididymis at differrrent developmental stages by qRT-PCR

2 MGP蛋白在不同發(fā)育階段大鼠附睪組織的定位

為進一步明確MGP在大鼠附睪發(fā)育過程的定位情況，我們利用免疫熒光染色觀察了MGP在附睪發(fā)育過程不同節(jié)段的表達。紅色熒光信號標(biāo)記的MGP在10d大鼠附睪組織起始部、頭部、體部和尾部均有少量表達。在3w大鼠附睪中， MGP信號較10d時增強，在附睪的各個節(jié)段均有表達。在7w大鼠附睪中，MGP的表達主要集中于附睪體部，尾部也有少量表達，而附睪起始部和頭部無明顯陽性信號。MGP在12w大鼠附睪組織的表達仍集中在體部和尾部，頭部有少量表達，但附睪起始部無明顯表達。此外，MGP與綠色熒光信號標(biāo)記的亮細胞標(biāo)志物B1-vATPase共存，表明MGP不僅表達于附睪上皮廣泛存在的主細胞內(nèi)，還在亮細胞中有表達（圖2）。

圖2大鼠不同發(fā)育階段附睪組織MGP表達的免疫熒光檢測。IS，initial segment；CPT，caput；CPS，corpus；CD，cauda；紅色，MGP；綠色，B1-vATPase；黃色，雙標(biāo)；比例尺，20μmFig. 2 Immunofluorescent staining identification of MGP in various developmental stages of rat epididymis. IS, initial segment; CPT, caput; CPS, corpus; CD, cauda; red, MGP; green, B1-vATPase; yellow, double labelling; scale bar, 20μm

討 論

哺乳動物的附睪在出生后要經(jīng)歷復(fù)雜的胚胎后發(fā)育過程才能成熟，附睪上皮逐漸分化成熟為不同種類的細胞后，對各種蛋白和離子高效動態(tài)的分泌與重吸收，逐步建立起穩(wěn)定精密的附睪管腔微環(huán)境[6]。在生理狀態(tài)下，精子在附睪中的成熟和維持靜息狀態(tài)高度依賴附睪微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，其中，附睪管腔鈣離子的穩(wěn)態(tài)對精子運動、代謝、頂體反應(yīng)等有至關(guān)重要的影響[2]。MGP作為鈣離子結(jié)合蛋白，在多種組織器官發(fā)揮重要的鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控作用[4]，因此，探究MGP在大鼠附睪胚胎后發(fā)育過程的表達和定位，將有助于揭示其與附睪上皮成熟和附睪管腔微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，尤其是鈣離子穩(wěn)態(tài)的建立過程的關(guān)系，為進一步探究其在附睪中的具體功能打下基礎(chǔ)。

從形態(tài)學(xué)角度劃分，附睪的胚胎后發(fā)育通常經(jīng)歷3個階段，分別為未分化期（出生后1～15d），分化期（出生后16～44d），增長期（出生44d后）[6]。此外，附睪的胚后發(fā)育還存在一些關(guān)鍵的時間節(jié)點，比如在3w時睪丸輸出小管形成，睪丸支持細胞（Sertoli cell）分泌的物質(zhì)經(jīng)由輸出小管運送到附睪，并調(diào)控附睪上皮細胞蛋白的表達[7]。我們的結(jié)果表明，MGP mRNA在附睪胚胎后發(fā)育未分化期內(nèi)表達量較低，而從6d至3w表達量逐漸升高并于3w達到頂峰，與睪丸內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)礁讲G的時間節(jié)點相對應(yīng)。研究表明MGP的啟動子含有維甲酸反應(yīng)元件（RA response element，RARE），維甲酸可激活其轉(zhuǎn)錄[8]，而哺乳動物睪丸組織含有豐富的維甲酸合成酶，睪丸內(nèi)維甲酸的主要來源為支持細胞[9]。因此我們推測MGP mRNA在3w的高表達與睪丸來源的維甲酸的轉(zhuǎn)錄激活作用有關(guān)。免疫熒光結(jié)果顯示，MGP在出生后10d和3w均在大鼠附睪各個節(jié)段廣泛表達，未呈明顯的節(jié)段特異性。MGP這種在胚胎后器官發(fā)育早期的廣泛表達也見于腎臟、肺、脾臟等組織器官，提示其對器官胚胎后發(fā)育的重要性。最近的研究表明，MGP通過與骨形成蛋白-4（bone morphogenetic protein 4, BMP-4）相互作用在胚胎期和胚胎后發(fā)育中參與肺葉分支的形態(tài)發(fā)生[10]。此外，在骨骼肌的早期發(fā)育過程MGP可調(diào)節(jié)生肌調(diào)控因子的表達以及影響細胞外基質(zhì)的重塑[11]。綜上我們推測，MGP在大鼠附睪胚胎后發(fā)育早期的表達可能參與調(diào)控附睪管腔形態(tài)的發(fā)生。

在附睪胚胎后發(fā)育的晚期（出生后5～6w），附睪上皮細胞分化成熟，蛋白表達模式與成年個體附睪相似[6]。另外兩個關(guān)鍵的時間節(jié)點為出生后7w，精子到達附睪頭部；出生后8w，精子到達附睪尾部[7]，在7～8w精子到達附睪時，附睪管腔微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的建立，尤其是對精子生理活動影響重大的鈣離子穩(wěn)態(tài)的建立至關(guān)重要。我們的結(jié)果顯示，MGP mRNA從出生后7～8w至12w表達量逐漸升高并維持在較高水平，提示MGP可能參與附睪管腔微環(huán)境的調(diào)控，為精子到達附睪后的成熟和儲存提供適宜條件。MGP是重要的組織異位鈣化抑制因子，基因型為MGP－／－的敲除鼠通常由于大血管鈣化、破裂，在6～8w齡前死亡。類似的大血管鈣化現(xiàn)象也在MGP羧化激活被抑制的大鼠模型中被觀察到[4]。體外實驗也表明，血管平滑肌細胞分泌的MGP激活被抑制后，細胞外鈣離子濃度顯著增高[12]。綜上，我們推測MGP在附睪胚胎后發(fā)育7～8w至個體成熟過程主要發(fā)揮附睪管腔鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用。附睪管腔鈣離子濃度由起始部至尾部呈梯度降低趨勢，并遠低于血鈣濃度，但附睪管腔維持低鈣穩(wěn)態(tài)的機制仍未被研究清楚。最近的研究表明鈣離子通道蛋白TRPV6和協(xié)同參與鈣離子跨上皮轉(zhuǎn)運的氯離子通道蛋白TMEM16A主要在附睪尾部遠端參與管腔鈣離子調(diào)控，但這種維持低鈣水平的機制在頭部，體部和尾部近段并不存在[13]。免疫熒光檢測顯示，在7w和12w大鼠附睪MGP的表達呈節(jié)段特異性，主要在附睪體部和尾部表達較高，這提示MGP可能在缺乏TRPV6-TMEM16A鈣調(diào)控的附睪體部和尾部發(fā)揮鈣穩(wěn)態(tài)的維持作用。此外，MGP廣泛表達于附睪上皮主細胞和亮細胞提示MGP對鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)可能涉及復(fù)雜蛋白的分泌與內(nèi)吞過程，其具體機制還有待進一步研究。需要指出的是，本實驗中MGP mRNA在大鼠附睪不同發(fā)育節(jié)點的表達量有趨勢變化，3w達峰值，但相鄰時間節(jié)點之間并無統(tǒng)計學(xué)差異，有待后續(xù)實驗擴大樣本量進一步驗證。

MGP在大鼠附睪胚胎后發(fā)育早期廣泛表達于各個節(jié)段提示其可能參與附睪管腔早期的形態(tài)發(fā)生，在發(fā)育晚期至附睪成熟后MGP在體部和尾部的節(jié)段性高表達表明其可能發(fā)揮附睪管腔鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控的作用。MGP對附睪發(fā)育的調(diào)控和附睪管腔鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)機制仍有待進一步闡明，這將有助于揭示男性精子成熟的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，進一步闡明男性不育的發(fā)病機理。