張多強，辛國軍

（西北民族大學(xué)第一附屬醫(yī)院（寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院）肝膽外科，銀川 750002）

枸 杞 多 糖（lycium barbarum polysaccharide，LBP）是枸杞子的提取物，具有多種生物活性作用[1]及抗腫瘤功能[2]，并能誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，從而抑制其增殖[3]。有研究報道，枸杞多糖在肝癌中也具有抑制腫瘤細胞增殖及促進凋亡作用[4]，但其對肝癌細胞遷移侵襲的影響尚未清楚。腫瘤血管的形成是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及腫瘤細胞吸取營養(yǎng)的基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在腫瘤血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。VEGF在肝癌組織中呈顯著高表達[6]，VEGF基因沉默可抑制肝癌細胞HepG2的遷移和侵襲的能力[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖可使肝癌細胞中VEGF蛋白的表達下降[8]，但VEGF在肝癌細胞中的表達及其與肝癌細胞遷移侵襲的關(guān)系尚不明確。本研究擬以肝癌細胞SMMC-7721為研究對象，檢測枸杞多糖處理的SMMC-7721細胞的增殖、遷移和侵襲，觀察沉默VEGF和過表達VEGF對SMMC-7721細胞遷移、侵襲的影響，明確枸杞多糖抑制SMMC-7721細胞遷移侵襲的機制是否與負調(diào)控VEGF有關(guān)，為枸杞多糖治療癌癥提供依據(jù)。

材料與方法

1 材料

人肝癌細胞SMMC-7721購自ATCC; DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT試劑、胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司；pcDNA 3.1載體、LipofectamineTM2000、BCA蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連Takara公司；Transwell小室、基質(zhì)膠購自美國Coming公司；SDS-PAGE 試劑盒、ECL發(fā)光液購自碧云天生物技術(shù)公司；兔抗人多克隆抗體MMP-2、兔抗人多克隆抗體MMP-9、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗均購自美國Santa Cruz 公司；兔抗人多克隆抗體VEGF 購自碧云天公司；PVDF膜購自德國羅氏診斷有限公司；Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國伯樂；枸杞多糖購自寧夏銀川市藥材公司；si-VEGF、si-NC均由上海吉瑪公司合成。

2 細胞培養(yǎng)

用含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)人肝癌細胞SMMC-7721，置于37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

3 細胞轉(zhuǎn)染與枸杞多糖處理

按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑說明書要求操作將si-VEGF、si-NC、pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-VEGF轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞，標記為si-VEGF組、si-NC組、LBP+pcDNA 3.1組、LBP+pcDNA 3.1-VEGF組，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，檢測轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

枸杞多糖處理：將SMMC-7721細胞調(diào)整密度至106個/ml，培養(yǎng)24h后，用枸杞多糖（0、100、200、400μg/ml）處理48 h，然后用于后續(xù)試驗。

4 MTT分析

取適量細胞，加入20μl 5g/ L的MTT溶液，培養(yǎng)4h，然后棄去上清，每孔加入150μl DMSO，震蕩使結(jié)晶溶解，在490 nm波長下檢測細胞吸光度（A）。細胞增殖抑制率 =1-AOD490樣品/AOD490對照×100%。

5 Transwell分析

將細胞以106個/孔接種于細胞6孔板，培養(yǎng)至融合度75% 時，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。調(diào)整細胞密度至105個/ml，取 100μl 加入上室內(nèi)，600μl含血清的培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)過夜。取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細胞，PBS洗滌，甲醇固定30min，0.1%結(jié)晶紫染色20min，PBS洗滌。顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細胞數(shù)，隨機選5個視野計數(shù)，取平均值。

將Transwell小室上表面鋪適量厚度的基質(zhì)膠，然后按照上述操作方法操作。最后顯微鏡下觀察小室下表面附著的侵襲細胞。

6 Western blot

收集細胞，加入裂解液，冰上裂解30min。12000r/min離心10min。取上清置于EP管，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10min。電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入一抗，4℃孵育過夜，洗膜，加二抗，4℃孵育2h。漂洗后用ECL試劑盒進行顯影曝光：滴加化學(xué)發(fā)光劑進行顯影，采用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。Quantity One 4.62圖像分析軟件進行條帶灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參，以目的條帶與βactin灰度值的比值表示目的蛋白的表達。

7 qRT-PCR分析

取適量材料方法3中的上述各組細胞，按RNA抽提試劑盒說明書要求操作提取RNA，進行定量。再將cDNA轉(zhuǎn)移至19℃室溫下，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書操作合成cDNA。最后嚴格按qRT-PCR試劑盒說明書操作步驟進行VEGF mRNA檢測，5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′（上游引物），和5′-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3′（下游引物）；用2-△△Ct計算VEGF mRNA的表達。

8 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進行分析。計量資料用均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 枸杞多糖抑制肝癌細胞增殖

運用MTT法檢測不同濃度LBP（0、100、200、400μg/ml）處理對肝癌細胞系SMMC-7721細胞增殖的影響。結(jié)果顯示，LBP處理SMMC-7721細胞48h能劑量依賴性抑制SMMC-7721細胞的增殖，其中100μg/ml LBP 的抑制率為 (4.49±1.34)%，100μg/ml LBP的抑制率達到(54.79±4.48)%（表1）。為了消除由于增殖抑制對實驗的干擾，選用抑制率在10%左右的濃度（100μg/ml） 作為遷移和侵襲實驗的藥物作用濃度 。

2 枸杞多糖抑制肝癌細胞遷移和侵襲

用Transwell法檢測顯示，100μg/ml LBP處理48h能顯著SMMC-7721細胞的遷移和侵襲（圖1，表2）。

表1不同濃度LBP對人肝癌細胞SMMC-7721的抑制作用Tab. 1 Inhibition effect of different concentrations of LBP on human liver cancer cell line SMMC-7721

圖1 Transwell分析檢測LBP對肝癌細胞遷移率和侵襲力的影響。比例尺，100μmFig. 1 Transwell assay for detection of the effect of LBP on migration and invasion of hepatoma cells. Scale bar, 100μm

表2 LBP對肝癌細胞遷移和侵襲影響的統(tǒng)計學(xué)分析Tab. 2 Statistical analysis for effect of LBP on migration and invasion of hepatoma cells

3 枸杞多糖抑制肝癌細胞中遷移和侵襲相關(guān)基因的表達

Western blot和qRT-PCR檢測顯示，100μg/ml LBP處理SMMC-7721細胞48h可顯著下調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白及其mRNA表達（圖2，表3）。

4 枸杞多糖下調(diào)SMMC-7721細胞VEGF表達

Western blot和qRT-PCR檢測顯示，100μg/ml LBP處理SMMC-7721細胞48h可顯著下調(diào)VEGF蛋白及其mRNA表達（圖3，表4）。

圖2 枸杞多糖（100μg/ml）對SMMC-7721細胞MMP-2、MMP-9表達影響的Western blot檢測Fig. 2 Western blotting detection for effect of LBP (100μg/ml) on expression of MMP-2 and MMP-9 in the SMMC-7721 cells

表3 LBP對SMMC-7721 細胞中MMP-2和MMP-9蛋白與mRNA表達影響的統(tǒng)計學(xué)分析Tab. 3 Statistical analysis for the effect of LBP on protein and mRNA expression of MMP-2 and MMP-9 in the SMMC-7721 cells

表4 LBP對SMMC-7721 細胞中VEGF蛋白與mRNA表達影響的統(tǒng)計學(xué)分析Tab. 4 Statistical analysis for the effect of LBP on protein and mRNA expression of VEGF in the SMMC-7721 cells

5 沉默VEGF的SMMC-7721細胞MMP-2和MMP-9水平下調(diào)遷移侵襲力降低

Western blot分析顯示，轉(zhuǎn)染si-VEGF的SMMC-7721細胞中VEGF顯著降低，同時，細胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9水平也顯著下調(diào)（圖4，表5）；Transwell分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染si-VEGF的SMMC-7721細胞的遷移力和侵襲力均顯著降低（表5）。

表5 沉默VEGF對SMMC-7721細胞MMP-2/MMP-9水平和遷移率侵襲力影響的統(tǒng)計學(xué)分析Tab. 5 Statistical analysis for effect of silencing VEGF on the levels of MMP-2//MMP-9 in and the ability of migration and invasion in the SMMC-7721 cells

圖4 沉默VEGF對SMMC-7721細胞MMP-2和MMP-水平影響的Western blot檢測Fig. 4 Western blotting detection for the effect of silencing VEGF on the levels of MMP-2 and MMP-9 in the SMMC-7721 cells

6 過表達VEGF逆轉(zhuǎn)枸杞多糖對SMMC-7721細胞遷移侵襲力的抑制

應(yīng)用Transwell實驗分析顯示，通過轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-VEGF在SMMC-7721細胞過表達VEGF后 （圖5），LBP抑制SMMC-7721細胞遷移率和侵襲力的作用明顯減弱（表6）。

圖5 SMMC-7721細胞中轉(zhuǎn)染過表達VEGF的Western blot檢測Fig. 5 Western blot detection for the efficiency of transfection with overexpressed VEGF in the SMMC-7721 cells

表6 過表達VEGF對 LBP抑制SMMC-7721細胞遷移侵襲作用影響的統(tǒng)計學(xué)分析Tab. 6 Statistical analysis for the effect of overexpression of VEGF on the inhibition of migration and invasion of SMMC-7721 cells by LBP

討 論

枸杞多糖是構(gòu)象呈高度支化狀的雜多糖，其主要藥理成分為當(dāng)歸多糖，具有抗腫瘤、抗輻射、補血、免疫調(diào)節(jié)等作用[9]，可通過誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞周期阻滯，對各種類型的癌細胞具有抗腫瘤活性，如可抑制裸鼠腫瘤生長[10-12]。早在2005年Zhang等[13]報道，LBP處理引起QGY7703細胞生長受抑制，S期循環(huán)停滯和凋亡誘導(dǎo)，且細胞中RNA的量和細胞內(nèi)Ca2+的濃度增加，提示細胞周期停滯和凋亡系統(tǒng)中細胞內(nèi)鈣的增加可能參與QPY7703細胞中LBP的抗增殖活性。幾年后，Zhang等[14]又發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖LBP-a8、LBP-a3、LBP-a1和LBP-a4均能夠以濃度和時間依賴的方式抑制SMMC-7721細胞增殖。李梅林等[15]發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖及枸杞硒多糖均可抑制肝癌細胞HepG2的增殖，但其作用機制尚未清楚，預(yù)測其在食品保健、醫(yī)藥中具有很大潛力。本研究運用MTT、Transwell檢測枸杞多糖處理的肝癌細胞SMMC-7721的增殖、遷移和侵襲發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖可呈濃度依賴性增加對SMMC-7721細胞增殖的抑制，以及抑制SMMC-7721細胞的遷移和侵襲；進一步深入研究檢測肝癌細胞中遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達發(fā)現(xiàn)，SMMC-7721細胞中MMP-2、MMP-9的表達下調(diào)。

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在癌癥中的作用并不局限于血管生成和血管通透性，也為腫瘤起始的重要組成部分，可能與癌癥的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16-18]。Tian等[19]發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖和丹參素能夠降低兔血管增生性視網(wǎng)膜病變過程中VEGF含量，提示通過改善缺氧環(huán)境或影響各種新生長因子，可以預(yù)防視網(wǎng)膜微血管病變的發(fā)生。Lin等[20]報道，新型抗VEGF人源化單克隆抗體BD0801對體外抑制HepG2、SMMC-7721和Bel7402細胞的增殖，同時誘導(dǎo)G1期細胞凋亡和細胞周期停滯，在體內(nèi)可抑制小鼠腫瘤異種移植物的生長并誘導(dǎo)HepG2和SMMC-7721腫瘤異種移植物的細胞凋亡，其機制與降低AKT、Erk1/2和Rb磷酸化和細胞周期蛋白D1有關(guān)，表明BD0801是一種有效的抗VEGF單克隆抗體，可用于治療HCC。本研究檢測了枸杞多糖處理的肝癌細胞SMMC-7721中VEGF的表達發(fā)現(xiàn)，VEGF表達明顯下調(diào)，與Tian的研究結(jié)果一致。進一步研究發(fā)現(xiàn)，沉默VEGF可降低SMMC-7721細胞的遷移和侵襲并下調(diào)遷移侵襲相關(guān)基因MMP-2、MMP-9的表達；過表達VEGF可逆轉(zhuǎn)枸杞多糖對肝癌細胞遷移、侵襲的抑制作用。因此，枸杞多糖抑制肝癌細胞的遷移和侵襲與其下調(diào)VEGF有關(guān)。這些結(jié)果為肝癌的VEGF靶向治療提供了重要依據(jù)。