呂豆，郗彥鳳，李靈敏，步鵬，喬愛琪，鄭文亮，郭艷琳*

（1山西醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，太原 030001；2山西省腫瘤醫(yī)院病理科，太原 030013）

肺癌是全球總?cè)丝谥邪l(fā)病率和致死率均占首位的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。在肺癌患者中，約85%為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），主要包括鱗癌和腺癌。近年來除傳統(tǒng)手術(shù)治療和放化療外，肺癌的靶向治療、免疫治療飛速發(fā)展，但NSCLC的5年生存率僅為18.6%，晚期NSCLC的5年生存率不足5%，仍有約60%的NSCLC患者治療手段有限，生存預(yù)后差[1]。深入研究肺癌發(fā)生進(jìn)展機(jī)制仍尤為重要。轉(zhuǎn)錄因子是一類能與特定DNA序列結(jié)合，調(diào)控靶基因以特定強(qiáng)度、時間、空間去表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，其功能異常是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)通過改變轉(zhuǎn)錄因子對腫瘤細(xì)胞重編程可以使惡性瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)成多能干細(xì)胞[2]，某些轉(zhuǎn)錄因子還是腫瘤治療過程中的重要藥物靶點(diǎn)。Hey1基因是堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basic-helix-loop-helix, bHLH）轉(zhuǎn)錄因子超家族HES/HEY家族成員，在細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡過程中發(fā)揮重要作用[3]。Hey1還是與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的 Notch[4]、TGF-β/BMP[5]、Smad[6]等多個信號通路的共同靶點(diǎn)。有研究表明Hey1的異常表達(dá)在多種腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后過程中發(fā)揮重要作用[7-12]。肺癌動物模型[13]和肺癌細(xì)胞系[14]的研究也發(fā)現(xiàn)Hey1存在異常表達(dá)，但Hey1基因在人肺癌組織中的表達(dá)狀況，及其與各臨床病理特征之間關(guān)系的研究尚未見報道。研究發(fā)現(xiàn)，作為Hey1最重要的激活通路之一，Notch信號通路的異常與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)，特別是Notch1的異常表達(dá)[15]。以往有關(guān)Notch1在非小細(xì)胞肺癌表達(dá)情況的研究較多，但結(jié)果并不完全一致[16-18]。因此，本研究除進(jìn)一步明確Notch1在NSCLC中的表達(dá)情況及意義外，著重研究Hey1在NSCLC中的表達(dá)情況，及其與Notch1的表達(dá)、各臨床病理特征之間的關(guān)系，為NSCLC的診斷、藥物靶向設(shè)計(jì)和預(yù)后判斷提供理論依據(jù)。

資料與方法

1 病例資料

收集山西省腫瘤醫(yī)院病理科2013年6月至2014年6月手術(shù)切除術(shù)前均未行放療或化療的肺癌病例，從中選出臨床資料完整和石蠟組織保存完好的病例共246例，其中，鱗癌118例，腺癌128例。男性176例，女性70例，年齡33歲-79歲，中位年齡62歲。TNM分期采用2018年第八版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期85例，Ⅱ期65例，Ⅲ期73例，Ⅳ期23例。隨訪截止2018年9月底。另取同期手術(shù)的117例癌旁正常肺組織作為對照。所用標(biāo)本均通過山西省腫瘤醫(yī)院倫理委員會審批（倫理編號：201845）。

2 制備組織芯片

采用芯片模具制作空白組織芯片。首先根據(jù)HE染色切片確定典型病變部位，而后用Marker筆在組織切片和相應(yīng)石蠟組織塊上標(biāo)記。用金屬空心管從已經(jīng)定位的目標(biāo)石蠟組織塊上鉆取組織，并轉(zhuǎn)移至空白組織芯片相應(yīng)位置。完成后，將做好的芯片置于60℃烤箱中烤10min、取出置室溫晾10min，同樣的步驟循環(huán)8h，使得鉆取組織和空白組織芯片融合。連續(xù)切片后，將切下的4μm芯片組織裱于經(jīng)防脫處理的載玻片上，置于67℃烤片機(jī)上烘烤50min后備用。

3 免疫組織化學(xué)染色

兔抗人Notch1單克隆抗體（ab52627）和兔抗人Hey1多克隆抗體（ab22614）購自Abcam。實(shí)驗(yàn)采用En Vision兩步法，分別用公司說明的陽性對照作為陽性對照，以0.01mol/L PBS（pH7.4）代替一抗作為陰性對照。將事先制備好的組織芯片切片放入羅氏Bench Mark XT半自動免疫組化染色儀，加一抗（Notch1 1∶100稀釋，Hey1 1∶150稀釋），蘇木精復(fù)染、固定、封固、觀察。

4 結(jié)果判讀

每例標(biāo)本隨機(jī)選取5個以上的高倍視野，選取具有代表性的區(qū)域。Notch1蛋白著色定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，Hey1蛋白著色定位于細(xì)胞核。按細(xì)胞著色程度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細(xì)胞所占比例評分：＜5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，≥75%為4分。然后將兩項(xiàng)得分相加，根據(jù)所得總分判斷結(jié)果：＞2為陽性[19]。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Notch1、Hey1蛋白陽性表達(dá)率采用百分率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)；生存分析采用Kaplan-Meier法估計(jì)各組患者累計(jì)存活率，并用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NSCLC組織與癌旁正常肺組織中Notch1和Hey1的表達(dá)

Notch1在肺鱗癌、肺腺癌和癌旁正常肺組織的陽性率分別為78.8%，28.9%和30.8%，其中鱗癌與腺癌、癌旁正常肺組織間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Hey1在肺鱗癌、肺腺癌和癌旁正常肺組織中的陽性率分別為79.7%，23.4%和33.3%，其中鱗癌與腺癌、癌旁正常肺組織間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肺腺癌組織中Notch1和Hey1陽性率略低于癌旁正常肺組織，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

圖 1 Notch1和Hey1在癌旁正常肺組織、肺鱗癌和肺腺癌中的表達(dá)。A，Notch1和Hey1表達(dá)的 EnVision法免疫組織化學(xué)檢測（比例尺，100μm）；B，Notch1和Hey1陽性率差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，肺鱗癌vs癌旁正常肺組織，P＜0.01；**，肺鱗癌vs肺腺癌，P＜0.01；Control，癌旁正常肺組織；SCC，肺鱗癌；AD，肺腺癌Fig. 1 Expression of Notch1 and Hey1 in adjacent normal lung tissues, lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma. A, Expression of Notch1 and Hey1 detected by EnVision method of immunohistochemical staining, scale bar 100μm; B, difference statistics analysis of positive rates of Notch1 and Hey1∶ *, lung squamous cell carcinoma vs normal adjacent lung tissue, P＜0.01; **∶ lung squamous cell carcinoma vs lung adenocarcinoma,P＜0.01; Control, adjacent normal lung tissue; SCC, lung squamous cell carcinoma; AD, lung adenocarcinoma

2 NSCLC組織中Notch1和Hey1表達(dá)與各臨床病理特征的關(guān)系

卡方檢驗(yàn)顯示，肺鱗癌患者Notch1陽性表達(dá)與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)，與性別、年齡、吸煙情況、原發(fā)腫瘤最大直徑、原發(fā)腫瘤部位及腫瘤分化程度無關(guān)；肺鱗癌患者Hey1陽性表達(dá)與TNM分期呈正相關(guān)，與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)，與性別、年齡、吸煙情況、原發(fā)腫瘤最大直徑、原發(fā)腫瘤部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)；肺腺癌患者Notch1和Hey1陽性表達(dá)與各臨床病理特征之間均無關(guān)（表1和表2）。

3 SCLC中Notch1與Hey1的表達(dá)相關(guān)性

肺鱗癌組織中Notch1表達(dá)與Hey1表達(dá)具有顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.253，P＜0.01），肺腺癌組織中Notch1表達(dá)與Hey1表達(dá)具有顯著的正相關(guān)關(guān)系（r=0.176，P＜0.05）（表3）。

4 Notch1和Hey1表達(dá)情況與肺鱗癌和肺腺癌患者生存期的關(guān)系

在246例非小細(xì)胞肺癌患者隨訪中，截止2018年9月底有222例患者具有完整的隨訪資料，其中死亡病例88例，至今生存病例134例。肺鱗癌患者Notch1和Hey1表達(dá)陰性組生存期高于陽性組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別P=0.116，P=0.102）；肺腺癌患者Notch1表達(dá)陰性組生存期高于陽性組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.100）；肺腺癌患者Hey1表達(dá)陽性組生存期與陰性組相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.492）（圖2）。

表 1 肺鱗癌中Notch1和Hey1的表達(dá)及其與臨床病理特征間關(guān)系Tab. 1 Expression of Notch1 and Hey1 in lung squamous cell carcinoma and their relationship with clinicopathological factors

討 論

大量研究表明Notch信號通路異常與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。Notch信號通路包括4個受體（Notch1-4）和5個配體（Jagged1，Jagged2，Delta-like1，Delta-like3和 Delta-like4）。 受 配 體Jagged/Delta激活，Notch受體經(jīng)兩次切割，釋放出Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Notch intracellular domain，NICD），NICD轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。以往有關(guān)Notch信號通路在肺癌發(fā)生進(jìn)展中作用的研究多集中于Notch1，結(jié)果顯示Notch1在肺鱗癌中高表達(dá)[16,17]，但在腺癌中的表達(dá)狀況存在分歧[16-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：肺鱗癌組織中Notch1陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常肺組織，提示Notch1可能促進(jìn)肺鱗癌的發(fā)生，與以往研究結(jié)果一致[16,17]；肺腺癌組織中Notch1陽性表達(dá)率低于癌旁正常肺組織，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。至于肺腺癌中Notch1表達(dá)結(jié)果的不一致，可能與實(shí)驗(yàn)所采用的樣本種類（石蠟組織標(biāo)本、細(xì)胞系）、檢測方法（免疫組織化學(xué)、Western blot）、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（Spearman相關(guān)分析、卡方檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)）等不同有關(guān)[16-18]。Hey1基因，作為Notch信號通路的直接靶標(biāo)和效應(yīng)子，編碼一個小的bHLH轉(zhuǎn)錄因子，主要通過直接結(jié)合核心啟動子或抑制其他轉(zhuǎn)錄激活因子來抑制靶基因的表達(dá)[20]。2012年Heisig等[21]通過GO分析發(fā)現(xiàn)：Hey1調(diào)節(jié)的基因有507個，與凋亡、RNA剪切定位、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色質(zhì)組裝、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。研究表明，Hey1在骨肉瘤、結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)[7-12]。Konishi 等[14]用實(shí)時定量PCR方法發(fā)現(xiàn)9個肺癌細(xì)胞系Hey1高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：肺鱗癌組織中Hey1陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常肺組織，提示Hey1的高表達(dá)可能參與肺鱗癌的發(fā)生。肺腺癌組織中Hey1陽性表達(dá)率低于癌旁正常肺組織，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表 2 肺腺癌中Notch1和Hey1的表達(dá)及其與臨床病理特征間關(guān)系Tab. 2 Expression of Notch1 and Hey1 in lung adenocarcinoma and their relationship with clinicopathological factors

表 3 Notch1和Hey1在肺鱗癌與肺腺癌中表達(dá)的相關(guān)性分析Tab. 3 Correlation between Notch1 and Hey1 expression in lung squamous cell carcinoma and lung adenocarcinoma

圖 2 Notch1和Hey1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后關(guān)系的Kaplan-Meier生存曲線分析Fig. 2 Kaplan-Meier survival curve analysis for the relationship of Notch1 and Hey1 expression with the prognosis of non-small cell lung cancer

我們對不同NSCLC病理組織學(xué)類型Nocth1和Hey1表達(dá)率分別做了組間比較，發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌和肺腺癌Notch1和Hey1表達(dá)情況明顯不同，甚至有完全相反的趨勢，二者在肺鱗癌表達(dá)均增高，而在肺腺癌組織中陽性表達(dá)率雖低于癌旁正常肺組織，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。出現(xiàn)這個結(jié)果的原因，推測可能與以下幾個因素有關(guān)：①肺鱗癌與肺腺癌雖然同屬于NSCLC，但起源于不同的肺部上皮細(xì)胞，具有不同的基因表達(dá)譜及生物學(xué)標(biāo)志物[22]；②調(diào)控肺鱗癌與肺腺癌的細(xì)胞微環(huán)境和細(xì)胞信號通路不同；③肺癌病理組織學(xué)類型不同，其發(fā)生、發(fā)展也不同；④病例數(shù)太少等。

研究證實(shí)，Notch1高表達(dá)與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)[16,17]。Hey1在多種實(shí)體瘤發(fā)生進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用：促進(jìn)骨肉瘤的侵襲和肺轉(zhuǎn)移[7]；與乳頭狀甲狀腺癌組織病理學(xué)分級、甲狀腺外侵，復(fù)發(fā)或軟組織轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[10]；與原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤分級相關(guān)[11]；在肝細(xì)胞癌中與病理分期正相關(guān)[12]。鑒于Nocth1和Hey1在肺鱗癌中的高表達(dá)，而在肺腺癌中的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，我們分別分析了二者與各臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺腺癌中Notch1和Hey1的表達(dá)與各臨床病理特征無明顯相關(guān)；肺鱗癌中Notch1的表達(dá)與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示檢測Notch1可作為判斷肺鱗癌惡性程度、侵襲和轉(zhuǎn)移的指標(biāo)，與以往研究一致。Hey1的表達(dá)與TNM分期和腫瘤分化程度TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，通常腫瘤的分化程度越低，其惡性程度越高，提示Hey1或許可以作為判斷肺鱗癌病理分級和惡性程度的輔助指標(biāo)，指導(dǎo)臨床治療方案的選擇。

本研究Spearman相關(guān)分析顯示，肺鱗癌和肺腺癌中Hey1表達(dá)與Notch1表達(dá)呈正相關(guān)?，F(xiàn)有研究表明，與腫瘤發(fā)生相關(guān)的調(diào)節(jié)Hey1的信號通路有Notch、TGF-β/BMP[5]、EGF-b/Smad[6]等，各通路間交叉、共同作用發(fā)揮生物學(xué)作用，提示Hey1在NSCLC中的表達(dá)雖受多條信號通路交叉作用，但可能至少部分是由Notch1來激活的。有關(guān)Notch1信號通路還有許多未評估的因子，NSCLC中Notch1信號通路的機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步的研究。

有研究通過生存分析顯示，NSCLC中Notch1陰性組患者生存期明顯高于陽性組[23]，但也有研究表明在肺腺癌中Notch1高表達(dá)預(yù)后好，而在肺鱗癌中沒有意義[24]。Hey1表達(dá)與胰腺癌的總生存率降低顯著相關(guān)[9]。本研究Kaplan-Meier生存曲線顯示，Notch1和Hey1表達(dá)與NSCLC患者的生存期均無明顯相關(guān)性?？紤]到本研究隨訪的時間有限，而且存在樣本數(shù)量偏少的問題，統(tǒng)計(jì)結(jié)果可能存在一定的偏倚。因此我們下一步將增加臨床樣本和隨訪時間做進(jìn)一步的研究。

綜上所述，Hey1和Notch1在NSCLC中存在差異性表達(dá)，在肺鱗癌組織中高表達(dá)，表明Hey1和Notch1是肺鱗癌發(fā)生、發(fā)展的重要參與因子，與肺鱗癌的惡性程度密切相關(guān)。Hey1在NSCLC中的表達(dá)可能至少部分是由Notch1來激活的。