李穎，劉玉珍，張雨晴，李新玲，牟光慶，妥彥峰，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034；2.新疆天潤乳業(yè)股份有限公司，新疆烏魯木齊830000）

1956年Harman 提出了自由基致衰理論，此后的大量研究證明自由基損傷可促使生命系統(tǒng)發(fā)生衰退性變化。自由基作用于機(jī)體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，造成氧化損傷，使細(xì)胞中毒凋亡，與衰老疾病密切相關(guān)。大部分的抗氧化劑來自于化學(xué)合成或天然物質(zhì)的提取物。隨著科學(xué)的進(jìn)步，越來越多的人認(rèn)識(shí)到化學(xué)合成抗氧化劑的危害，而天然物質(zhì)的提取又因?yàn)榉蛛x鑒定、復(fù)配、改性等問題的限制，阻礙了其發(fā)展。微生物資源豐富，生產(chǎn)周期短，原料低廉。微生物發(fā)酵法在將來很可能成為大規(guī)模獲得食用抗氧化劑的一條有效途徑[1]。

乳酸菌的抗氧化活性已得到了體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)的證實(shí)[2-3]，早在1900年人們就已發(fā)現(xiàn)常食含有乳酸菌的乳制品有利于人的健康長壽[4]，乳酸菌對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生、衰老過程和應(yīng)激反應(yīng)等發(fā)生作用[5]，有專家指出氧化應(yīng)激與慢性疾病和機(jī)體衰老密切相關(guān)，如何增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力預(yù)防疾病與衰老，成為研究的熱點(diǎn)課題之一[6]。食用必需量的天然抗氧化劑可有效預(yù)防氧化應(yīng)激，乳酸菌（Lactobacillus，LAB）作為一種優(yōu)質(zhì)天然抗氧化劑，其抗氧化功能備受關(guān)注。結(jié)合乳酸菌具有的保健特性和天然無毒、能貫穿食品加工過程等的特點(diǎn)，勢(shì)必成為人們首先考慮的新型抗氧化劑[7]。

本試驗(yàn)以大連工業(yè)大學(xué)大連益生菌功能特性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從健康人糞便中分離出的7 株植物乳桿菌為對(duì)象，通過對(duì)其抗氧化能力的測(cè)定，篩選具有抗氧化活性的乳桿菌并分析乳桿菌可能的的抗氧化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）和大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）為大連工業(yè)大學(xué)大連市益生菌功能研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存菌株；MRS 肉湯培養(yǎng)基（生物試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；過氧化氫：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二苯基苦基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazy1，DPPH）、鄰二氮菲、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸：美國SIGMA 公司；無水乙醇、硫酸亞鐵、三氯化鐵：天津市大茂化學(xué)試劑廠；抗壞血酸（VC）：天津市津科精細(xì)化工研究所；以上試劑均為分析純。T-AOC 試劑盒、SOD試劑盒、GSH 試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器設(shè)備

KG-SX-500 滅菌鍋：上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；FQC 生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；S210-k 精密pH 計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；1510 酶標(biāo)儀：美國Thermo Fisher Scientific 公司；CKX41 倒置電子顯微鏡：日本OLYMPUS 公司；Z326K型冷凍離心機(jī)：德國HERMLE Labortechnlk GmbH；AW200SG 型厭氧工作站：英國Electrotek 公司；超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（Scientz-IID）：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 健康人類糞便中乳桿菌的篩選

取近期未食用含乳酸菌食物或藥物的健康人（年齡18～25 歲）的糞便0.5 g～1 g，置于滅菌后的4.5 mL濃度為0.9%的生理鹽水中，用無菌生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋，采用涂布平板法，分別取10-4、10-5、10-6系列稀釋液各100 μL 涂布在無菌MRS 瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37 ℃的厭氧工作站（氣體組成：10%氫氣，10%二氧化碳和80%氮?dú)猓┡囵B(yǎng)48 h。待長出菌落，在MRS平板上劃線純化，于37 ℃的厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)。選取接觸酶陰性和革蘭氏陽性菌作為備選菌株，進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序鑒定。并對(duì)菌種凍存保藏。

1.3.2 乳酸菌的培養(yǎng)及菌體、無細(xì)胞提取物的制備

根據(jù)黃玉軍等[8]報(bào)道的方法制備菌體及無細(xì)胞提取物。備選菌株按2%（體積分?jǐn)?shù)）比例接種于MRS 培養(yǎng)液，于37 ℃培養(yǎng)18 h；菌株連續(xù)活化兩代后，按2%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種于5 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，收集菌體。將離心后的菌體用pH7.40 的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3 次后，重懸于PBS 中，調(diào)整菌數(shù)至109CFU/mL（OD600nm≈0.7），得到待測(cè)菌體，然后將菌數(shù)為109CFU/mL的菌體，超聲波冰浴破碎細(xì)胞（工作時(shí)間6 s，間隔時(shí)間9 s，10 min，輸出功率200 W），在10 000 r/min，4 ℃離心10 min，上清液即為無細(xì)胞提取物并放于-20 ℃保存。

1.3.3 清除DPPH 自由基能力的測(cè)定

采用Mu 等[9]報(bào)道的方法測(cè)定備選菌株菌體和無細(xì)胞提取物的清除DPPH 自由基能力。DPPH 溶于無水乙醇，濃度為0.2 mmol/L；將1 mL 備選菌株菌懸液（或無細(xì)胞提取物）加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH，室溫20 ℃下避光反應(yīng)30 min，4 000 r/min 離心10 min，于517 nm 處測(cè)定上清液的吸光度。

樣品對(duì)DPPH 的清除率/%=[1-（Ai-A）j/A）c]×100

式中：Ai為1 mL 的DPPH+1 mL 樣品的吸光度；Aj為1 mL 無水乙醇+1 mL 樣品的吸光度；Ac為1 mL DPPH+1 mL 無水乙醇的吸光度。

1.3.4 對(duì)不同濃度H2O2溶液耐受能力的測(cè)定

參照Mu 等[9]報(bào)道的方法測(cè)定試驗(yàn)菌株對(duì)不同濃度H2O2溶液的耐受能力。在無菌的MRS 培養(yǎng)液中加入不同體積的20 mmol/L H2O2溶液，總體積為5 mL，使過氧化氫的終濃度為0、0.4、0.8、1.0 mmol/L。按2%的接種量加入MRS 培養(yǎng)液，37 ℃厭氧培養(yǎng)8 h，在600 nm 波長下測(cè)定培養(yǎng)液吸光度值。吸光度值越大說明菌液濃度越大，從而判定試驗(yàn)菌株對(duì)H2O2溶液耐受能力。

1.3.5 清除羥自由基（·OH-）能力的測(cè)定

參照Mu 等[9]報(bào)道的方法測(cè)定備選菌株對(duì)·OH-的清除作用，略有修改。反應(yīng)混合物含有1.0 mL PBS（0.02 mol/L，pH 7.4），0.5 mL 鄰二氮菲（2.5 mmol/L），0.5 mLFeSO（42.5 mmol/L），0.5 mL H2O（220 mmol/L）和0.5 mL 菌體或無細(xì)胞提取物，在37 ℃水浴反應(yīng)1.0 h，將混合液4 000 r/min 離心10 min，于536 nm 處測(cè)定吸光度?？瞻坠苡谜麴s水代替。樣品為按1.3.2 方法制備的7 株試驗(yàn)菌株及陰陽性對(duì)照菌大腸桿菌、LGG 的菌體及無細(xì)胞提取物。

自由基的清除率/%=（A樣品－A對(duì)照）（/A空白－A對(duì)照）×100

式中：A對(duì)照為不加樣品，加入H2O2的吸光度；A空白為不加樣品，不加H2O2的吸光度；A樣品為加入樣品和H2O2的吸光度。

1.3.6 清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力的測(cè)定

參照張江巍等[3]報(bào)道的方法測(cè)定備選菌株菌體或無細(xì)胞提取物清除超氧陰離子自由基的能力。在離心管中依次加入2 mLTris-HCl 緩沖液（150 mmol/L，pH=8.20），0.6 mL 樣品（109CFU/mL），對(duì)照組加入PBS，25 ℃恒溫預(yù)熱10 min，最后加入25 ℃預(yù)熱后的1.2 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.4 mL（用10 mmol/L HCl 溶液配制），混勻后25 ℃恒溫水浴反應(yīng)20 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液在325 nm 處測(cè)吸光度，試驗(yàn)做3 個(gè)平行，重復(fù)2 次，求平均值。樣品為按1.3.2 方法制備的7 株試驗(yàn)菌株及陽性對(duì)照菌LGG 的菌體及無細(xì)胞提取物。

超氧陰離子自由基清除率/ %=[1－（OD1－OD2）/（OD2－OD4）]×100

式中：OD1為含樣品和鄰苯三酚的吸光度；OD2為含樣品不含鄰苯三酚的吸光度；OD3為不含樣品含鄰苯三酚的吸光度；A4為不含樣品和鄰苯三酚的吸光度；

1.3.7 總還原力的測(cè)定

參照Wu 等[10]報(bào)道的方法測(cè)定備選菌株菌體或無細(xì)胞提取物的總還原能力。反應(yīng)體系中加入待測(cè)樣品0.5 mL、1%鐵氰化鉀0.5 mL、0.2 mol/L（pH=6.60）PBS 0.5 mL 于10 mL 離心管中50 ℃水浴20 min，急速冷卻后，加入10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）0.5 mL，3 500 r/min 離心10 min。吸取上清液1 mL，加入0.1%的FeCl3溶液1 mL 于700 nm 處測(cè)定吸光度值。以PBS代替菌液作空白對(duì)照。樣品為按1.3.2 方法制備的7株試驗(yàn)菌株及陽性對(duì)照菌LGG 的菌體及無細(xì)胞提取物。

還原能力/%=（As-Ap）/Ap×100

式中：As為樣品的吸光度；Ap為空白的吸光度。

1.3.8 總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）的測(cè)定

根據(jù)備選菌株DPPH 自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除能力、耐受過氧化氫及還原能力，篩選獲得抗氧化指標(biāo)較高的菌株，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

選用南京建成總抗氧化能力試劑盒[11]對(duì)菌株2號(hào)、3 號(hào)及陽性對(duì)照菌LGG 的菌體和無細(xì)胞提取物進(jìn)行檢測(cè)。

總抗氧化能力/mL=（測(cè)定OD值－對(duì)照OD值）×反應(yīng)量總量×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)（/0.01×30×取樣量）

1.3.9 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的測(cè)定

采用試劑盒檢測(cè)菌株2 號(hào)、3 號(hào)及陽性對(duì)照菌LGG 的無細(xì)胞提取物的超氧化物歧化酶（SOD）活力，方法及試劑的配制參照產(chǎn)品說明進(jìn)行。

SOD 抑制率/%=（[A對(duì)照－A對(duì)照空白）－（A測(cè)定－A測(cè)定空白）]/（A對(duì)照－A對(duì)照空白）×100%

OD活力（/U/mL）=SOD 抑制率/50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)×0.24 mL×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)（5 倍）1.3.10 微量還原型谷胱甘肽（micro reduced glutathione，GSH）含量的檢測(cè)

本試驗(yàn)選用GSH 試劑盒檢測(cè)菌株2 號(hào)、3 號(hào)及陽性對(duì)照菌LGG 的無細(xì)胞提取物的含量，方法及試劑的配制參照產(chǎn)品說明進(jìn)行。

GSH 含量/（μmol/L）=[（測(cè)定OD值－對(duì)照OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值－空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（20 μmol/L）×樣品前處理稀釋倍數(shù)（5 倍）]

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行方差分析，差異顯著性檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)和單因素方差分析（ANOVE，LSD）。所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，p＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌株的菌落形態(tài)及鑒定結(jié)果

本研究從2 份健康人糞便中分離出7 株符合乳酸菌特性的桿菌，編號(hào)分別為1、2、3、4、5、7、8。7 株乳酸菌的外觀形態(tài)均為表面光滑、濕潤，邊緣整齊或略微凸起的乳白色不透明菌落，經(jīng)革蘭氏染色呈陽性、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)呈陰性，可初步認(rèn)定為乳桿菌。經(jīng)過16S rDNA 測(cè)序鑒定，確定7 株為植物乳桿菌。鑒定結(jié)果如表1。

表1 菌種鑒定結(jié)果Table 1 Strains of appraisal results

2.2 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

分別測(cè)定7 株備選菌株的菌體和無細(xì)胞提取物對(duì)DPPH 自由基的清除率，以VC為對(duì)照，結(jié)果見表2。

由表2可知，7 株植物乳桿菌的菌體及無細(xì)胞提取物對(duì)DPPH 自由基均有一定的清除能力，但菌體的DPPH 自由基清除能力均明顯大于無細(xì)胞提取物的清除能力，菌體的清除率達(dá)18.12%～30.35%，無細(xì)胞提取物的清除率達(dá)7.55%～12.07%。VC的清除能力最強(qiáng)。大腸桿菌對(duì)DPPH 自由基清除率高的主要原因是大腸桿菌是一種過氧化氫酶陽性菌，在其細(xì)胞中含有內(nèi)源過氧化氫酶。以上結(jié)果與楊靜秋[12]的研究結(jié)果相似，完整菌體清除DPPH 自由基的活性較高，因此可以初步推測(cè)乳酸菌清除DPPH 的活性物質(zhì)主要存在于菌體表面和代謝產(chǎn)物中，而不是細(xì)胞內(nèi)[13]。有報(bào)道顯示，乳酸菌具有DPPH 自由基清除活性可能和菌體產(chǎn)生的胞外多糖有關(guān)，Xu 等[14]的研究顯示DPPH 自由基的清除活性與由雙歧桿菌分離出的胞外多糖的濃度呈正相關(guān)。

表2 不同菌株對(duì)DPPH 自由基的清除能力Table 2 DPPH free radical scavenging ability of different strains

2.3 乳桿菌對(duì)不同濃度過氧化氫溶液的耐受能力

備選菌株分別接種于含有不同濃度的過氧化氫MRS 培養(yǎng)基中，檢測(cè)培養(yǎng)8 h 后培養(yǎng)液在600 nm 處的吸光度值，評(píng)價(jià)菌株對(duì)過氧化氫的耐受能力，結(jié)果見表3。

由表3可知，隨著過氧化氫濃度的增加，接種不同菌株MRS 培養(yǎng)液的吸光度值均有不同程度下降，說明過氧化氫對(duì)菌株產(chǎn)生了氧化損傷。當(dāng)培養(yǎng)液中過氧化氫濃度為1.0 mmol/L 時(shí)，接種菌株2、4 及對(duì)照菌株培養(yǎng)液的吸光度值無顯著差異，而接種菌株1、3、7 的培養(yǎng)液吸光度值顯著高于接種LGG 吸光度值，說明菌株1、3、7 對(duì)濃度為1.0 mmol/L 過氧化氫具有較強(qiáng)耐受性。該結(jié)果與車馳等[15]的研究結(jié)果一致，結(jié)果表明，8 株乳桿菌對(duì)不同濃度的過氧化氫都有一定的耐受能力，但不同菌株的耐受能力不同。

表3 含有H2O2 培養(yǎng)基中乳桿菌的菌體濃度（OD600）Table 3 Cell concentration of Lactobacillus containing H2O2 medium

2.4 羥自由基（OH·）清除能力的測(cè)定

備選菌株的菌體及無細(xì)胞提取物對(duì)羥自由基的清除能力結(jié)果見表4。

表4 不同菌株對(duì)羥自由基的清除能力測(cè)定Table 4 Determination of scavenging ability of hydroxyl free radicals by different strains

由表4可知，7 株菌株對(duì)羥自由基均有一定的清除作用。其中1、2、3 號(hào)菌株的菌體清除率較高，與兩株對(duì)照菌株之間存在顯著差異（p＜0.05）。2、3 號(hào)菌株的無細(xì)胞提取物的清除率與陽性對(duì)照菌株LGG 無顯著差異，與陰性對(duì)照（大腸桿菌）之間差異顯著（p＜0.05）。此外，在此試驗(yàn)條件下發(fā)現(xiàn)1、2、3、5、7 號(hào)菌株及陰性對(duì)照大腸桿菌的菌體羥自由基清除率均高于其無細(xì)胞提取物，然而4、8 號(hào)菌及LGG 3 株菌的菌體羥自由基清除率均低于其無細(xì)胞提取物。劉少敏[16]研究了嗜酸乳桿菌（Lactobacillius acidophilus）NCFM，植物乳桿（Lb.plantarum）ATCC 14917，鼠李糖乳桿菌（Lb.rhamnosusGG，LGG）和植物乳桿菌（Lb.plantarum）NDC 75017 對(duì)羥自由基清除能力的影響，發(fā)現(xiàn)LGG 的羥自由基清除能力最強(qiáng)。羥自由基能夠降解DNA，損傷細(xì)胞膜和多糖化合物，是最主要的能夠?qū)е轮|(zhì)過氧化和多種人體細(xì)胞損傷的自由基[17]。乳酸菌菌體具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力可歸結(jié)為在乳酸菌細(xì)胞內(nèi)存在著針對(duì)Cu2+和Fe2+的天然螯合物質(zhì)，Cu2+和Fe2+能夠參與到機(jī)體多種氧化過程中，因此乳酸菌對(duì)Cu2+和Fe2+的螯合作用，能夠從根本上減少羥自由基的產(chǎn)生[18]。本研究中備選菌株對(duì)Cu2+和Fe2+的螯合作用還有待進(jìn)一步研究。

2.5 超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力的測(cè)定

備選菌株的菌體及無細(xì)胞提取物對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 同等濃度的不同菌株對(duì)O2-·的清除能力Table 5 The same concentration of different strains of O2-free radicals scavenging ability

由表5可知，在濃度為109cfu/mL 時(shí)，無細(xì)胞提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除率均高于菌體，其中菌株5、8 與陽性對(duì)照菌株LGG 菌體之間無顯著差異。其余菌株的菌體清除率與對(duì)照之間差異顯著（p＜0.05）。所有菌株的無細(xì)胞提取物的清除率與陽性對(duì)照之間無差異顯著。所有菌株的菌體及無細(xì)胞提取物均具有大于50%的超氧陰離子自由基清除能力。乳酸菌菌體及無細(xì)胞提取物具有超氧陰離子自由基清除能力可能是由于其菌體細(xì)胞及代謝產(chǎn)物中存在各種各樣的氧化酶，有報(bào)道顯示，乳酸菌存在不同的活性氧族（reactive oxygenspecies，ROS）解毒機(jī)制，包括過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和各種各樣的氧化酶[12]。

2.6 總還原力的測(cè)定

備選菌株的菌體及無細(xì)胞提取物的總還原能力的測(cè)定結(jié)果見表6。

表6 乳酸菌總還原能力的測(cè)定Table 6 Total reducing capacity determination of lactic acid bacteria

由表6可知，各菌株菌體的還原能力均強(qiáng)于無細(xì)胞提取物，菌株2 的菌體及無細(xì)胞提取物的還原能力最強(qiáng)，分別為39.64%、27.58%，且與對(duì)照組無顯著差異，其余除3 號(hào)菌的無細(xì)胞提取物外，菌體和無細(xì)胞提取物的還原能力均與對(duì)照組差異顯著（p＜0.05）。說明乳酸菌具有還原能力的活性物質(zhì)的含量不僅在不同菌株間具有差異，在乳酸菌不同部位也存在較大差異。菌株無細(xì)胞提取物各抗氧化指標(biāo)均低于完整菌體，也可能是由于超聲破碎使部分發(fā)揮抗氧化活性的細(xì)胞物質(zhì)失活。Lin 等[19]在對(duì)19 株乳酸菌無細(xì)胞提取物進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，受試的19 株菌均具有還原能力。

2.7 總抗氧化能力（T-AOC）的測(cè)定

經(jīng)過測(cè)定7 株備選菌株對(duì)3 種自由基清除能力、過氧化氫耐受能力以及總還原力，結(jié)果表明菌株2 的菌體對(duì)DPPH 自由基的清除率高達(dá)到30.35%，對(duì)羥自由基的清除率達(dá)41.35%，還原能力高達(dá)39.64%，高于試驗(yàn)所用其他菌株，無細(xì)胞提取物對(duì)羥自由基的清除率高達(dá)到31.50%，與陽性對(duì)照菌株LGG 無顯著差異。菌株3 對(duì)3 種自由基的清除率較高，處于較穩(wěn)定的狀態(tài)。從而挑選出2、3 號(hào)菌株進(jìn)行總抗氧化能力、SOD 和GSH 酶活性的研究。

2、3 號(hào)及LGG 菌株的菌體及無細(xì)胞提取物的總抗氧化能力的測(cè)定結(jié)果見表7。

表7 總抗氧化能力測(cè)定Table 7 Total antioxidant capacity determination

由表7可知，菌株2 的菌體的總抗氧化能力與菌株LGG 無顯著差異，但無細(xì)胞提取物的總抗氧化能力顯著（p＜0.05）高于LGG 無細(xì)胞提取物總抗氧化能力。陳明[20]研究了不同植物乳桿菌的總抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)無論是在發(fā)酵上清液還是在無細(xì)胞提取物中菌株BX62、24-7 和XM5 都具有較高的T-AOC 活性。

2.8 超氧化物歧化酶（SOD）活力的測(cè)定

對(duì)篩選出來的2、3 號(hào)菌及LGG 菌株的無細(xì)胞提取物進(jìn)行SOD 活性測(cè)定，結(jié)果見表8。

本反應(yīng)體系中SOD 抑制率為50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD 活力單位（U）。菌株3 的SOD 抑制率和SOD 活力最強(qiáng)。但3 種菌株SOD 抑制率和SOD 活力無顯著差異（p＜0.05）。張江巍等[2]篩得的抗氧化乳酸菌L4 具有SOD 活性；大多數(shù)乳酸菌是通過產(chǎn)生超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶清除羥自由基和過氧化氫[21-24]。Lee 等[25]為探索乳酸菌抗氧化機(jī)制，測(cè)定了菌株L．plantarumKCTC 3099 螯合金屬離子及SOD 活性，結(jié)果表明受試菌SOD 活性極低，但螫合Fe2+、Cu2+的能力分別為13.6 mg/kg 和23.9 mg/kg，因此推斷乳酸菌抗氧化能力來自于菌體螯合金屬離子的能力。

表8 SOD 活力的測(cè)定Table 8 Determination of SOD activity

2.9 微量還原型谷胱甘肽（GSH）含量的檢測(cè)

對(duì)篩選出來的2、3 號(hào)及LGG 菌株的無細(xì)胞提取物進(jìn)行GSH 含量測(cè)定，結(jié)果見表9。

表9 還原型谷胱甘肽（GSH）的測(cè)定Table 9 Determination of reduced glutathione（GSH）

由表9可知，所有菌株均存在GSH，3 株菌GSH含量差異不顯著。谷胱甘肽過氧化物酶是一種重要的催化過氧化氫分解的酶，它的作用是保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整延遲細(xì)胞的衰老，也具有一定的清除O2－·的能力[26]。GSH 具有清除自由基和抗氧化作用，如體內(nèi)產(chǎn)生的過氧化氫、氫過氧化物（ROOH）、過氧化物自由基（R·）等均能被清除[27]。很多研究認(rèn)為，乳酸菌的抗氧化作用是由胞內(nèi)抗氧化成分和氧化還原調(diào)控系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)完成的，乳酸菌自身能產(chǎn)生GSH 和SOD等抗氧化酶和非酶類抗氧化劑，也可通過菌體產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)氧化還原電位而清除自由基，降低氧化應(yīng)激[28]。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明篩選出的2 號(hào)及3 號(hào)植物乳桿菌具有抗氧化活性。乳酸菌完整菌體與無細(xì)胞提取物抗氧化活性的不同，可能與超聲處理對(duì)菌體活性成分的影響有關(guān)，完整活菌體狀態(tài)下，菌體表面成分、細(xì)胞內(nèi)容物均參與清除自由基等抗氧化的過程。本研究中抗氧化活性隨菌體及試驗(yàn)方法的不同而不同，因此有必要進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)及動(dòng)物試驗(yàn)，驗(yàn)證菌株的抗氧化性能。