王希，朱攀宇，蔣榮娜，劉燚琳，王宗成，*

（1.株洲市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南株洲412000；2.湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南永州425199）

香菇（Lentinus edodes（Berk.）sing）為真菌科擔(dān)子菌綱傘菌目傘菌科香蕈，又名香蕈、冬菇，是一種木腐菌，子實(shí)體單生、叢生或群生[1-2]。香菇為藥食同源的中藥材，用于益氣不饑，治風(fēng)破血、化痰理氣、益味助食、預(yù)防佝僂病、預(yù)防身體衰弱、毛細(xì)血管破裂、牙床以及腹腔出血[3]。香菇多糖是香菇中主要的活性成分，香菇多糖通過刺激機(jī)體增加免疫因子的釋放量增加，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，且不會(huì)損傷正常細(xì)胞的作用，臨床上主要用于癌癥的輔助治療[4]。香菇多糖同時(shí)能夠提高巨噬細(xì)胞的吞噬作用，增加體內(nèi)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，近代研究表明香菇多糖在提高免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗肝炎、抗氧化方面均具有很好的藥理作用[5-7]。據(jù)文獻(xiàn)記載，香菇多糖的提取方法主要為熱水提取法、堿水浸提法、微波輔助提取、超聲輔助提取等[8-9]。超聲波所特有的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)，對(duì)提取的香菇多糖有助溶作用[10]。趙謀明等[11]研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理能有效降低香菇多糖溶液的黏度，提高香菇多糖的溶解性。鄒林武等[12]發(fā)現(xiàn)，超聲波不但不會(huì)破壞香菇多糖的結(jié)構(gòu)，而且會(huì)增加香菇多糖的支鏈，在一定程度上提高了香菇多糖的抗氧化性能。江永香菇蓋頭碩大、色澤自然、香氣獨(dú)特，與江永香柚、香芋、香姜、香米統(tǒng)稱為“江永五香”[13]。從香菇中提取香菇多糖的報(bào)道較多，但未發(fā)現(xiàn)有從江永香菇中提取香菇多糖的報(bào)道，此外通過超聲波細(xì)胞破碎法輔以熱水浸提香菇多糖的研究也未見系統(tǒng)報(bào)道。因此，本項(xiàng)目采用超聲波輔助熱水法提取江永香菇多糖，研究江永香菇多糖提取工藝并測(cè)定其抗氧化活性，以期為江永香菇綜合利用開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

江永香菇：購于永州市零陵區(qū)河西市場(chǎng)，將干香菇放入烘箱中干燥4 h 至恒重，粉碎過40 目篩得細(xì)粉，放入烘箱中備用。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；95%乙醇、ABTS、DPPH：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TE124S 型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；JYD-1200L 型超聲波細(xì)胞破碎儀：上海之信儀器有限公司；TG16G 型離心機(jī)：湖南凱達(dá)儀器有限公司；UV2800S 型分光光度計(jì)：上海舜宇恒平儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)[13]，配置0.1（mg/mL）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后稀釋為不同濃度的葡萄糖溶液，采取苯酚-硫酸法顯色，于490 nm 處測(cè)定溶液的吸光值，繪制吸光值為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。得出的回歸方程為：y=0.905 7x+0.224 9（R2=0.995 5）。

1.3.2 香菇多糖的提取

精確稱取干燥至恒重的香菇粉末10 g，用去離子水調(diào)節(jié)料液比，超聲波細(xì)胞破碎一定時(shí)間，再進(jìn)行熱水浸提，在4 000 r/min 的條件下離心10 min，取其上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約50 mL，用3 倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇析過夜，抽濾，取得沉淀，烘干至恒重，即為香菇多糖[14]。

1.3.3 香菇多糖含量測(cè)定及得率

精確稱取0.1 g 香菇多糖，溶于蒸餾水并定容至50 mL，然后吸取此溶液2 mL 并用蒸餾水定容至50 mL，再取1.0 mL 稀釋后的溶液，參照1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法測(cè)定香菇多糖的含量[15]。

式中：c代表稀釋后的濃度，g/mL，V表示初次定容的體積，mL；D表示稀釋倍數(shù)；m 表示香菇質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

考察料液比、超聲功率、超聲時(shí)間、浸提時(shí)間、浸提溫度5 個(gè)影響因素對(duì)江永香菇多糖得率的影響。

1）超聲時(shí)間：在料液比1 ∶30（g/mL）、超聲功率400 W 下超聲細(xì)胞破碎一定時(shí)間，再于80 ℃下浸提60 min，考查超聲時(shí)間（1、2、3、4、5、6 min）對(duì)香菇多糖得率的影響。

2）超聲功率：在料液比1 ∶30（g/mL）、一定超聲功率下超聲細(xì)胞破碎5 min，再于80 ℃下浸提60 min，考查超聲功率（200、300、400、500、600、700 W）對(duì)香菇多糖得率的影響。

3）料液比：在一定料液比、超聲功率400 W 下超聲細(xì)胞破碎5 min，再于80 ℃下浸提60 min，考查料液比[1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）]對(duì)香菇多糖得率的影響。

4）浸提時(shí)間：在料液比1 ∶30（g/mL）、超聲功率400 W 下超聲細(xì)胞破碎5 min，再于80 ℃下浸提，考查浸提時(shí)間（20、30、40、50、60、70 min）對(duì)香菇多糖得率的影響。

5）浸提溫度：在料液比1：30（g/mL）、超聲功率400 W 下超聲細(xì)胞破碎5 min，再于一定溫度下浸提60 min，考查浸提溫度（50、60、70、80、90、100 ℃）對(duì)香菇多糖得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)

對(duì)單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，以浸提溫度、浸提時(shí)間、超聲時(shí)間3 個(gè)因素為自變量，以香菇多糖得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.3.6 抗氧化性試驗(yàn)

將超聲波細(xì)胞破碎法輔以熱水浸提得到的江永香菇多糖（CD-lentinus）和熱水回流提取得到的江永香菇多糖（HW-lentinus）溶解稀釋成不同濃度，進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定。

1.3.6.1 香菇多糖DPPH 自由基清除能力的測(cè)定

在試管中分別加入4.0 mL 不同濃度香菇多糖溶液，加入4.0 mL 0.3 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，振蕩搖勻，靜置30 min，在517 nm 波長(zhǎng)下，用蒸餾水調(diào)零，測(cè)定吸光度（Ai），空白對(duì)照組以4.0 mL 蒸餾水代替樣品，加入4.0 mL DPPH 乙醇溶液，測(cè)定517 nm 波長(zhǎng)下的吸光度（Ao），同時(shí)在4.0 mL 樣品溶液中加入4.0 mL 乙醇，測(cè)定在517 nm 下的吸光度（Aj），以相應(yīng)濃度的VC作為對(duì)照[16]，操作同上，DPPH 自由基的清除率按下列公式計(jì)算。

式中：Ao代表不加香菇多糖的吸光度；Ai為測(cè)定液的吸光度；Aj為香菇多糖的本體的吸光度。

1.3.6.2 香菇多糖ABTS+自由基清除率的測(cè)定

依次在試管中加入2.0 mL 不同濃度香菇多糖溶液，再加入2.0 mL ABTS 溶液，靜置6 min，在734 nm可見光波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值（Ai），以2.0 mL 的蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照，在734 nm 波長(zhǎng)下測(cè)吸光度Ao，以相應(yīng)的質(zhì)量濃度的VC作對(duì)照[16]。

式中：Ao為不加香菇多糖的吸光度；Aj為樣品的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)得率的影響見圖1。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on the yield

如圖1所示，隨超聲細(xì)胞破碎時(shí)間的延長(zhǎng)，香菇多糖的得率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為5 min 時(shí)，香菇多糖的得率最大，少于5 min 時(shí)，增加非常明顯，但是大于5 min 反而減少。可能由于超聲波具有的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，可在極短的時(shí)間內(nèi)，擊碎細(xì)胞壁，促使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，提高香菇多糖的溶出度，但是時(shí)間太長(zhǎng)，可能會(huì)使其他成分浸出較多競(jìng)爭(zhēng)溶劑，影響產(chǎn)品的質(zhì)量和得率[18]，因此選擇4min～6 min 進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.2 超聲功率對(duì)得率的影響

超聲功率對(duì)得率的影響見圖2。

如圖2所示，隨著超聲功率的增大，香菇多糖的得率呈現(xiàn)先遞增后減小趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率為500 W 時(shí)，香菇多糖的得率最大，但是400 W～600 W，香菇多糖的得率變化不明顯?？赡苡捎诔暡üβ瘦^小時(shí)，超聲波細(xì)胞破碎效果隨功率增加而增加，但是超聲功率過大時(shí)，會(huì)使其他成分浸出較多競(jìng)爭(zhēng)溶劑，影響產(chǎn)品的質(zhì)量和得率[18]，因此宜選擇超聲功率為500 W。

圖2 超聲功率對(duì)得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the yield

2.1.3 料液比對(duì)得率的影響

料液比對(duì)得率的影響見圖3。

圖3 料液比對(duì)得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield

如圖3 香菇多糖的得率隨著料液比的減小呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，料液比為1 ∶25（g/mL）時(shí)，接近于穩(wěn)定，溶劑過大，加熱成本增加，提取設(shè)備容積也需要更大，為了節(jié)省成本，料液比1 ∶25（g/mL）較佳。

2.1.4 浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響

浸提時(shí)間對(duì)得率的影響見圖4。

圖4 浸提時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield

如圖4所示，在浸提時(shí)間為50 min 時(shí)，香菇多糖得率最高，當(dāng)?shù)陀?0 min 時(shí)，得率增加明顯，超過50 min 后反而稍減少，可能由于浸提時(shí)間過長(zhǎng)，香菇多糖結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致得率稍減少，為了節(jié)約生產(chǎn)時(shí)間，宜選取浸提時(shí)間為40 min～60 min。

2.1.5 浸提溫度對(duì)提取率的影響

浸提溫度對(duì)得率的影響見圖5。

圖5 浸提溫度對(duì)得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on yield

如圖5所示，隨著浸提溫度的升高，香菇多糖的得率在80 ℃達(dá)到最大值，后逐漸降低。溫度過高，可能會(huì)破壞香菇多糖，使多糖降解，此外要在高溫下進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，將消耗更多的能量，在一定程度上，增大了生產(chǎn)成本，選取浸提溫度為80 ℃為宜。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及其分析

2.2.1 設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

由于超聲功率在500 W 時(shí)香菇多糖得率最高，且超聲功率在400 W～600 W 范圍內(nèi)得率變化不明顯；此外料液比不宜過大，1 ∶25（g/mL）時(shí)提取香菇多糖較充分，因此固定超聲功率500 W 和料液比1 ∶25（g/mL），選擇浸提時(shí)間、浸提溫度、超聲時(shí)間3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化香菇多糖提取工藝，具體因素及水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface design

表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The experimental design and results of response surface method

2.2.2 數(shù)據(jù)模型的建立和分析

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行回歸擬合，得到多糖得率（Y）對(duì)試驗(yàn)因素的回歸方程為：

Y=27.53+1.35A+0.36B+4.30C-0.19AB+0.60AC+0.23BC-3.05A2-2.75B2-1.34C2。

公式為二次多元方程，方程中的二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)值，可知拋物面的開口向下，成倒V 字形，每個(gè)面上，存在一個(gè)最大值，因此可推測(cè)出最優(yōu)提取條件。系數(shù)絕對(duì)值的大小可以反映因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，由一次項(xiàng)系數(shù)可得出，提取香菇多糖的主次影響因素順序?yàn)椋撼晻r(shí)間＞浸提時(shí)間＞浸提溫度。

2.2.3 回歸模型的方差分析

為進(jìn)一步確定各因素對(duì)香菇多糖得率的影響程度和可靠性，對(duì)回歸模型進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface design experiment

模型的P=0.000 8 ＜0.01，是顯著的，說明模型是可行的，失擬項(xiàng)＞0.05，不顯著，說明不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)，當(dāng)前模型與實(shí)際擬合度較好，R2adj=0.960 9 和相關(guān)系數(shù)R2=0.990 2，也說明該模型擬合程度良好。A、C、A2和B2均小于0.05，說明超聲時(shí)間和浸提時(shí)間的一次項(xiàng)、超聲時(shí)間和浸提溫度的二次項(xiàng)均存在顯著性，由表中的P值也可以印證上述的影響因素順序?yàn)椋撼晻r(shí)間對(duì)香菇多糖的得率影響最大，其次是浸提時(shí)間，浸提溫度影響最小。

2.2.4 響應(yīng)面分析

通過Design-Expert 8.0.6 軟件模擬三因素之間的交互作用響應(yīng)曲面圖，如圖6～圖8。從3D 響應(yīng)面圖可以看出，各個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響程度。響應(yīng)曲面的坡度陡峭程度說明影響因素對(duì)響應(yīng)值的影響大小[19]，圖7 的響應(yīng)面較為陡峭，說明超聲時(shí)間和浸提時(shí)間的交互作用較大，但是由表3可知，3 個(gè)交互作用均未達(dá)到顯著性水平。

圖6 浸提溫度和浸提時(shí)間的交互作用Fig.6 Extraction temperature and extraction time on the yield of interaction

圖7 超聲時(shí)間和浸提時(shí)間的交互作用Fig.7 Ultrasonic time and extraction time on the yield of interaction

圖8 超聲時(shí)間和浸提溫度的交互作用Fig.8 Ultrasonic time and extraction temperture on the yield of interaction

2.2.5 提取條件的優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過軟件對(duì)回歸方程的進(jìn)一步優(yōu)化，由以上試驗(yàn)的結(jié)果分析，香菇多糖的最佳的提取工藝是浸提時(shí)間51.25 min、浸提溫度為77.89 ℃、超聲時(shí)間為5.95 min，結(jié)合實(shí)際情況最佳工藝條件調(diào)整為：超聲時(shí)間6 min、浸提溫度78 ℃、浸提時(shí)間51 min。在此條件下，經(jīng)過3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，江永香菇多糖的得率可達(dá)到29.71%。

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 香菇多糖的DPPH 自由基的清除能力

香菇多糖的DPPH 自由基清除能力見圖9。

圖9 不同濃度的江永香菇多糖和VC 的DPPH 自由基清除能力Fig.9 DPPH free radical clearance rate of different concentrations of polysaccharide from Lentinus edodes from Jiangyong and VC

超聲波細(xì)胞破碎法輔以熱水浸提得到的江永香菇多糖（CD-lentinus）和熱水回流提取得到的江永香菇多糖（HW-lentinus）均具有一定的DPPH 自由基清除能力，雖然弱于VC，但是與濃度呈正相關(guān)，且CDlentinus對(duì)DPPH 自由基清除能力較HW-lentinus強(qiáng)。CD-lentinus、HW-lentinus和VC清除DPPH 自由基的IC50分別為0.35、0.46 mg/mL 和0.07 mg/mL，說明江永香菇多糖對(duì)DPPH 自由基具有較高清除作用。

2.3.2 香菇多糖的ABTS+自由基的清除能力

香菇多糖的ABTS+自由基清除能力見圖10。

圖10 不同濃度的江永香菇多糖和VC 的ABTS+自由基清除能力Fig.10 ABTS+free radical clearance rate of different concentrations of polysaccharide from Lentinus edodes from Jiangyong and VC

ABTS+自由基清除能力通常用于反應(yīng)物質(zhì)的總的抗氧化能力，在波長(zhǎng)為734 nm 下測(cè)定的吸光度可用來評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力。如圖10，CD-lentinus和HWlentinus均具有一定的ABTS+自由基清除能力，雖然弱于VC，但是與濃度呈正相關(guān)，且CD-lentinus對(duì)ABTS+自由基清除能力較HW-lentinus強(qiáng)。CD-lentinus、HWlentinus和VC清除ABTS+自由基的IC50分別為1.76、2.32 mg/mL 和0.22 mg/mL，說明江永香菇多糖對(duì)ABTS+自由基具有較高清除作用。

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化了江永香菇多糖提取工藝條件，得出超聲波細(xì)胞破碎法輔以熱水浸提香菇多糖的最佳提取工藝為超聲時(shí)間6 min、浸提溫度78 ℃、浸提時(shí)間51 min。在此條件下，江永香菇多糖的得率可達(dá)到29.71%。

本試驗(yàn)測(cè)定了江永香菇多糖的抗氧化活性，超聲波細(xì)胞破碎法輔以熱水浸提江永香菇多糖體外清除DPPH 自由基能力的IC50值為0.35 mg/mL，清除ABTS+自由基能力的IC50值為1.76 mg/mL，其DPPH 自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力均高于熱水回流提取得到的江永香菇多糖，但低于VC。從抗氧化性結(jié)果看出，江永香菇多糖活性較高，應(yīng)用于抗氧化保健產(chǎn)品具有開發(fā)前景。