崔欣悅，凌空，周明，王雨晴，谷瑞增，陸路

（中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京100015）

我國(guó)是柑橘主要原產(chǎn)國(guó)之一，有著長(zhǎng)達(dá)4 000 余年的種植史，種植面積及總產(chǎn)量位居世界第一（2016年產(chǎn)量達(dá)3600 萬(wàn)噸）[1]。柑橘類(lèi)產(chǎn)品因易剝皮和口感良好等優(yōu)勢(shì)受到消費(fèi)者青睞。近年來(lái)，隨著柑橘加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，非冷凍濃縮汁（non-frozenconcentrate，NFC），罐頭，蜜餞和果酒等加工產(chǎn)品地位不斷上升。柑橘皮做為主要加工副產(chǎn)物，約占主要果重的25%～40%，主要由黃酮類(lèi)物質(zhì)，纖維素，果膠，維生素C，類(lèi)胡蘿卜素和果膠等成分組成[2]，具有良好的利用價(jià)值。而在我國(guó)，對(duì)于柑橘皮的處理主要采用填埋處理方法，不再進(jìn)行進(jìn)一步的深加工處理，造成環(huán)境的嚴(yán)重污染和資源浪費(fèi)[3]。

陳皮，又名橘皮、貴老、紅皮、黃橘皮、廣橘皮、新會(huì)皮、柑皮、或廣陳皮，是蕓香科柑橘屬植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮。市場(chǎng)中常見(jiàn)的陳皮主要分為川陳皮，廣陳皮，江西陳皮等，主要產(chǎn)于我國(guó)四川、江西、廣東和湖南等地。陳皮因具有健脾理氣，燥濕化痰等功效常被用于傳統(tǒng)中藥當(dāng)中。陳皮中主要活性成分為黃酮類(lèi)物質(zhì)及其揮發(fā)油。黃酮具有多種生物活性，特別是在抗腫瘤、降血脂和抗氧化等方面[4-6]。中醫(yī)理論認(rèn)為“陳久者良”即其貯存時(shí)間越久其藥理活性越強(qiáng)，其中的黃酮類(lèi)物質(zhì)含量會(huì)隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加而增加[7]，這也使得年份較久的陳皮價(jià)格相對(duì)于年份較短的價(jià)格要高出很多。

本試驗(yàn)以柑橘皮做為原料，5 種實(shí)驗(yàn)室自行分離鑒定的乳酸菌做為出發(fā)菌，利用微生物發(fā)酵技術(shù)將其中黃酮類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行提取并盡可能提高其含量，再與市售陳皮中的黃酮含量進(jìn)行對(duì)比，隨后通過(guò)單因素、響應(yīng)面等試驗(yàn)方法，對(duì)其發(fā)酵過(guò)程條件進(jìn)行優(yōu)化，以尋得最佳發(fā)酵工藝手段。為開(kāi)發(fā)利用柑橘皮中的主要活性物質(zhì)資源，發(fā)展高效微生物發(fā)酵手段奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

柑橘皮：市售；菌種：5A-1-1（類(lèi)干酪乳桿菌）；1C-2（短乳桿菌）；ff001（植物乳桿菌植物亞種）；ff002（嗜酸乳桿菌）；ff003（腸膜明串珠菌腸膜亞種）：均來(lái)自實(shí)驗(yàn)室內(nèi)自行鑒定保藏；MRS 培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；川陳皮素、桔紅素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、木犀草素、柚皮素、芹菜素和異鼠李素，純度均≥99%：上海源葉生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）：德國(guó)Merck；甲酸（色譜純）：迪馬科技；乙酸銨（質(zhì)譜純）：Sigma-Aldrich；試驗(yàn)用超純水（18.2 MΩ·cm）由Milli-Q 純水系統(tǒng)制備。

pH 計(jì)（S20P 型）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；粉碎機(jī)（JS39D-250 型）：蘇泊爾電器；生物安全柜（1389A2 型）：美國(guó)Thermo；恒溫震蕩培養(yǎng)箱（HZQ-211C 型）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；水浴鍋：蘇州珀瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超高效液相色譜儀Nexera X2、三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)（具體包括：LC-30AD×2 輸液泵，SIL-30AC 自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，CBM-20A 系統(tǒng)控制器，LCMS-8060 三重四極桿質(zhì)譜儀，LabSolutions Ver. 5.91 色譜工作站）：島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；分析天平（XS205DU 型）：美國(guó)Mettler Toledo；渦旋混合儀（QL-901 型）：中國(guó)其林貝爾儀器制造有限公司

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵柑橘皮工藝流程

發(fā)酵柑橘皮的工藝流程如圖1所示。

圖1 柑橘皮發(fā)酵工藝流程Fig.1 The fermentation process of citrus peel

1.2.2 柑橘皮發(fā)酵液中黃酮含量的測(cè)定

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取9 種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品粉末20.0 mg，加甲醇溶解，渦旋混勻，定容至100 mL，即得200 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取500 μL 上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，定容至10 mL，得到混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液10 μg/mL。將上述混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液用純甲醇逐級(jí)稀釋至0.98、1.95、3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

液相色譜條件：色譜柱：Shim-pack GIST（2.1 mm I.D.×100 mm L.，3 μm）；流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸、1 mmol/L乙酸銨水溶液，B 為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：B 相初始濃度為20%；0～6.0 min，20%～50%B；6.0 min～8.0 min，50%～80%B；8.0 min～8.1 min，80%～100%B；8.1 min～10 min，100%B；10 min～10.1 min，100%～20%B；10.1 min～14 min，20%B；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣體積：1 μL；柱溫：40 ℃。質(zhì)譜條件：離子化模式：ESI；加熱模塊溫度：400 ℃；霧化氣流速：3.0 L/min 干燥氣流速：10.0 L/min；接口電壓：4 kV；加熱氣流速：10.0 L/min；DL 溫度：250 ℃；接口溫度：300 ℃。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

選擇發(fā)酵前后黃酮含量變化最高的一株單菌種進(jìn)行單因素試驗(yàn)考察，分別對(duì)碳源添加量、接種量、發(fā)酵時(shí)間及皮水比進(jìn)行考核，探究相關(guān)因素對(duì)發(fā)酵過(guò)程中橘皮總黃酮（mg/g）含量的影響，確定各單因素合適的發(fā)酵條件，為柑橘皮中總黃酮含量的提高提供參考范圍，每個(gè)因素設(shè)置3 個(gè)平行。

1.2.4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平，選取碳源添加量（A），接種量（B），發(fā)酵時(shí)間（C）為試驗(yàn)因素。采用中心組合試驗(yàn)Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平，如表1所示，試驗(yàn)結(jié)果用Design Expert 8.1 分析，確定各因素及因素之間的交互作用對(duì)橘皮中總黃酮含量的影響，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件[8-9]。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of Box-Behnken experiment

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌種的篩選

利用三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)條件對(duì)5 株不同乳酸菌發(fā)酵的柑橘皮發(fā)酵液進(jìn)行黃酮含量測(cè)定，其測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

如圖2所示，利用三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)5 株單菌在發(fā)酵過(guò)程中9 種不同黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量變化進(jìn)行測(cè)定。發(fā)酵液中檢測(cè)到的川陳皮素、桔紅素及蘆丁含量較高，其中不同菌株在發(fā)酵過(guò)程中的川陳皮素含量均有所升高，菌株5A-1-1 變化尤為明顯。相對(duì)于川陳皮素而言，發(fā)酵液中的槲皮素、金絲桃苷、木犀草素、芹菜素、異鼠李素及柚皮素等含量較低，在發(fā)酵過(guò)程中各菌株變化趨勢(shì)不同，且通過(guò)圖2b 及圖2g可以發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加ff002 中的槲皮素及ff001 中的芹菜素在發(fā)酵后期的含量降至0 μg/kg，這說(shuō)明乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中充分分解利用了這部分的黃酮以滿足自身的生長(zhǎng)所需。黃酮類(lèi)物質(zhì)含量隨著發(fā)酵過(guò)程中交替增減，可以推測(cè)在乳酸菌的作用下，柑橘皮中的黃酮產(chǎn)生了復(fù)雜形勢(shì)的生物轉(zhuǎn)化。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中不同種類(lèi)黃酮含量測(cè)定Fig.2 The concentration of different kinds of flavonoid during fermentation process

采用液相色譜對(duì)不同菌株發(fā)酵過(guò)程中總黃酮含量的變化進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵液中總黃酮含量測(cè)定Fig.3 The content changes of total flavonoids

同時(shí)，對(duì)總黃酮的變化量進(jìn)行計(jì)算（圖3），同起始發(fā)酵液中的總黃酮濃度相比，含5 株單菌的發(fā)酵液中的總黃酮含量均有增加，其中5A-1-1 變化含量與其他單菌相比最為明顯，由0.132 mg/g 變化至0.174 mg/g。綜合分析發(fā)現(xiàn)，菌株5A-1-1 在發(fā)酵過(guò)程中的黃酮含量顯著升高，繼而選為最優(yōu)菌用于單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面分析。

2.2 單因素影響試驗(yàn)

2.2.1 碳源添加量的影響

在接種量為3%、發(fā)酵時(shí)間為5 d、皮水比為1 ∶4（質(zhì)量比）的條件下，不同比例的碳源添加量對(duì)發(fā)酵液中總黃酮含量影響見(jiàn)圖4。

圖4 碳源添加量對(duì)發(fā)酵液中總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of carbon sources addition on the content of total flavonoids in orange peel

當(dāng)碳源添加量為總體積分?jǐn)?shù)的3%時(shí)，發(fā)酵液中的總黃酮含量最高，隨后隨著碳源添加的增加而減少，說(shuō)明在一定添加量的基礎(chǔ)上，碳源的增加不會(huì)提高橘皮發(fā)酵液中總黃酮的含量，可能會(huì)使黃酮在發(fā)酵液中分解，考慮到這一點(diǎn)，遂選取2%、3%、4%的碳源添加量進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.2.2 接種量的影響

在碳源添加量為3%、發(fā)酵時(shí)間為5 d、皮水比為1 ∶4（質(zhì)量比）的條件下，考察不同接種量比例對(duì)發(fā)酵液中黃酮含量的影響如圖5所示。

圖5 接種量對(duì)發(fā)酵液中總黃酮含量的影響Fig.5 Effect of inoculum concentration on the content of total flavonoids in orange peel

研究結(jié)果表明，隨著接種量的升高，發(fā)酵液中的黃酮含量在接種量為3%時(shí)達(dá)到最高為0.198 mg/kg，隨后逐漸下降，故選擇接種量為2%、3%、4%做響應(yīng)面分析。

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間的影響

在碳源添加量為3%、接種量為3%、皮水比為1 ∶4（質(zhì)量比）的條件下，不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中黃酮含量的影響如圖6所示。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)橘皮中總黃酮的影響Fig.6 Effect of fermentation time on the content of total flavonoids in orange peel

由圖6可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為2 d 時(shí)，發(fā)酵液中的黃酮含量最高為0.19 mg/kg，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵液液中的黃酮含量逐步減少，這可能由于培養(yǎng)基中相關(guān)營(yíng)養(yǎng)成分被消耗，菌種還是利用黃酮以滿足自身代謝需求，選擇1、2、3 d 為發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.2.4 皮水比的影響

在碳源添加量為3%、接種量為3%、發(fā)酵時(shí)間為5 d 條件下，不同比例的橘皮與水的皮水比對(duì)發(fā)酵液中黃酮含量的影響如圖7所示。

圖7 皮水質(zhì)量比對(duì)橘皮中總黃酮的影響Fig.7 Effect of solid-liquid mass ratio on the content of total flavonoids in orange peel

由圖7可知，皮水比為1 ∶4（質(zhì)量比）時(shí)得到的發(fā)酵液總黃酮含量最高。測(cè)定結(jié)果表明，過(guò)低皮水比1 ∶1（質(zhì)量比）或過(guò)高皮水比1 ∶8（質(zhì)量比）均會(huì)影響發(fā)酵液狀態(tài)。當(dāng)皮水比過(guò)低時(shí)由于底物濃度過(guò)大，會(huì)對(duì)酶的催化起到抑制作用，同樣，當(dāng)皮水比過(guò)高時(shí)，酶濃度過(guò)低，酶解反應(yīng)不夠充分，導(dǎo)致發(fā)酵液中總黃酮的含量降低。綜合考慮，為得到總黃酮含量較高的發(fā)酵液，在進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)，將選擇1 ∶4（質(zhì)量比）的皮水比進(jìn)行試驗(yàn)，不再考慮其他皮水比。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

根據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，對(duì)數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and result of response surface experiment

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for quadric regression model

利用Design-Expert 8.0 軟件，對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸擬合，建立的回歸方程如下所示：

Y=-0.312 22+0.141 87A+0.165 62B+0.109 50C+0.018755AB+3.45000×10-3AC-0.020758BC-0.031467A2-0.024 425B2-0.014 765C2。（式中Y：總黃酮含量預(yù)測(cè)值；A、B、C分別代表碳源添加量、接種量、發(fā)酵時(shí)間的編碼值。）

從表3 方差分析結(jié)果可得出，整體模型的F=78.94，P＜0.000 1，表明試驗(yàn)所采用二次回歸方程模型高度顯著，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。試驗(yàn)的失擬項(xiàng)P=0.218 4＞0.05，無(wú)失擬因素存在，對(duì)模型有利。同時(shí)該模型方程決定系數(shù)R2=0.990 2，表明回歸方程擬合程度良好，自變量與響應(yīng)面之間線性關(guān)系顯著，能夠用于橘皮中總黃酮含量檢測(cè)試驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)[10]。對(duì)比影響總黃酮含量的因素為：碳源添加量（A）＞接種量（B）＞發(fā)酵時(shí)間（C）。

采用Box-Behnken 試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)碳源添加量、接種量、發(fā)酵時(shí)間3 個(gè)因素交互作用進(jìn)行分析，分析結(jié)果如圖8所示。

由圖8可以看出，對(duì)碳源添加量、接種量、發(fā)酵時(shí)間3 個(gè)因素交互作用分析，得到了交互因子的響應(yīng)曲面圖。其分析表明等高線圖均為橢圓形，響應(yīng)面三維圖均有穩(wěn)定點(diǎn)，且為極大值。結(jié)果顯示接種量和碳源添加量、接種量和發(fā)酵時(shí)間均具有交互性（P＜0.05），碳源添加量和發(fā)酵時(shí)間的交互作用不具有顯著性（P＞0.05）。通過(guò)數(shù)據(jù)的處理分析，得到響應(yīng)面R 的最大預(yù)測(cè)值為0.214 247mg/g，此時(shí)碳源添加量為3.25%、接種量2.97%、發(fā)酵時(shí)間2 d。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，采用優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行試驗(yàn)，3 次試驗(yàn)檢測(cè)出的總黃酮含量平均值為（0.208 667±0.008）mg/g。實(shí)際值與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明該回歸模型優(yōu)化的發(fā)酵工藝是有效的。

圖8 Box-Behnken 試驗(yàn)?zāi)Ｐ晚憫?yīng)面三維圖和等高線圖Fig.8 Response surface three-dimensional diagrams and contour maps of Box-Behnken experiment

3 討論與結(jié)論

本研究以新鮮柑橘皮為主要發(fā)酵原料，利用試驗(yàn)室5 種不同乳酸菌對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，通過(guò)LC-MS 對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)酵液中的黃酮類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明柑橘皮中富含多種黃酮類(lèi)物質(zhì)成分，其中以川陳皮素、桔紅素及蘆丁為主。川陳皮素及桔紅素是多甲氧基黃酮中的兩類(lèi)常見(jiàn)物質(zhì)，其廣泛存在于柑橘屬植物中，由于其具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗誘變等生理活性[11-13]，近年來(lái)得到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的較多專(zhuān)注，Whitman SC 等[14]研究發(fā)現(xiàn)川陳皮素可有效減少血漿膽固醇在體內(nèi)的富集，從而抑制巨噬細(xì)胞的形成來(lái)阻止抗動(dòng)脈粥樣硬化。李蘭英等[15]研究表明陳皮中多甲氧基黃酮類(lèi)成分可以抑制人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 及HepG2 細(xì)胞的生長(zhǎng)，并對(duì)其增殖呈現(xiàn)時(shí)間和濃度的依賴(lài)性。

采用5 種實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)乳酸菌菌種進(jìn)行前期初步篩選，通過(guò)發(fā)酵液中黃酮含量的對(duì)比篩選出發(fā)酵性能優(yōu)良的一株乳酸菌（5A-1-1），在一定皮水比前處理的基礎(chǔ)上，探究柑橘皮發(fā)酵最佳工藝條件，確定碳源添加量、接種量及發(fā)酵時(shí)間的最佳組合，其最佳發(fā)酵工藝條件為：碳源添加量為3.25%、接種量2.97%、發(fā)酵時(shí)間2 d，皮水比1 ∶4（質(zhì)量比），在該發(fā)酵條件下可有效提高發(fā)酵液中總黃酮含量，其得率由0.17 mg/g 提高至0.208 mg/g。

本試驗(yàn)通過(guò)發(fā)酵手段及對(duì)發(fā)酵條件的有效控制實(shí)現(xiàn)對(duì)柑橘皮的深加工處理，提高了生物轉(zhuǎn)換效率，最大程度實(shí)現(xiàn)其本身功能物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和利用，避免了環(huán)境污染與資源浪費(fèi)，同時(shí)為今后利用柑橘皮發(fā)酵工藝實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。