邱寶山 蔡穎 廖夢詩 林晶 范玉華○☆

腦白質(zhì)病變是腦小血管病的一種重要類型，臨床表現(xiàn)無特異性，通常表現(xiàn)為認知障礙、癡呆及自主神經(jīng)功能紊亂等，臨床診斷主要依據(jù)影像學(xué)上T2WI及FLAIR像側(cè)腦室旁及深部白質(zhì)高信號[1-4]。腦白質(zhì)病變的發(fā)病機制尚不明確，可能與血腦屏障破壞、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮細胞-周細胞功能失調(diào)、腦血流自動調(diào)節(jié)等因素有關(guān)，目前臨床無有效治療方法[5-8]。有髓神經(jīng)纖維由軸索和髓鞘組成，為研究軸索微結(jié)構(gòu)，軸索又可分為郎飛結(jié)、結(jié)側(cè)區(qū)、近結(jié)側(cè)區(qū)和結(jié)間區(qū)4個區(qū)域，接觸蛋白相關(guān)蛋白（contactin-associated protein,Caspr）是結(jié)側(cè)區(qū)軸膜的特異性蛋白，正常的軸索微結(jié)構(gòu)是有髓神經(jīng)纖維跳躍式傳導(dǎo)的基礎(chǔ)[9]。目前腦白質(zhì)病變典型病理改變是髓鞘缺失[10]，但對于白質(zhì)纖維軸索微結(jié)構(gòu)病理改變的研究甚少，為此，我們通過建立易卒中型腎血管性高血壓大鼠-雙側(cè)頸總動脈夾閉模型（stroke-prone renovascular hypertensive rats-2 vessel occlusion,RHRSP-2VO），觀察腦白質(zhì)病變中軸索微結(jié)構(gòu)的變化，為臨床診斷與治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組18只4周齡健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（廣東省實驗動物中心），體質(zhì)量約70 g～90 g。所有大鼠均飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)實驗動物中心（SPF級環(huán)境），隨機分為假手術(shù)組（n=9）和手術(shù)組（n=9），實驗過程全部遵循科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2易卒中型高血壓大鼠慢性全腦低灌注模型的建立 手術(shù)組按照雙腎雙夾術(shù)構(gòu)建RHRSP動物模型[10]，3個月后取收縮壓≥180 mmHg的大鼠按照頸總動脈夾閉的方法行右側(cè)頸總動脈夾閉術(shù)，24 h后以同樣方法行左側(cè)頸總動脈夾閉術(shù)。假手術(shù)組僅暴露雙側(cè)腎動脈和雙側(cè)頸總動脈，其余操作與手術(shù)組一致。

1.3 Morris水迷宮實驗雙側(cè)頸總動脈夾閉后12周進行Morris水迷宮實驗，實驗流程參照既往研究中的步驟進行[11]，實驗前1 d讓大鼠在池中自行游泳180 s以適應(yīng)水溫和環(huán)境，第1～5天為定位航行試驗（III象限中間放置平臺，大鼠按4個象限入水點順序放入水池，每只大鼠入水順序相同，入水開始至登入平臺為逃避潛伏期，如果60 s未找到平臺則引導(dǎo)其登上平臺，此時記錄為（60 S），以每天4個入水點的逃逸潛伏期均數(shù)記錄為每天的逃逸潛伏期；第6天為空間搜索試驗，撤掉平臺，記錄60 s穿越平臺次數(shù)。

1.4腦組織取材與病理學(xué)水迷宮實驗結(jié)束后，對所有大鼠行灌注取腦；用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注后取出大腦，于4%多聚甲醛浸泡24 h，于嗅球后方1.5 mm處取4 mm厚腦組織，包埋后制成冠狀面連續(xù)石蠟切片（3 μm）。 Hematoxylin-eosin（HE）染色、Luxol fast blue（LFB）染色、免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色方法步驟參照既往研究進行[10]，免疫染色中所用抗體和濃度分別為小鼠抗大鼠MBP（1∶500，Abcam）、兔抗大鼠 Olig2（1∶200，Gene Tex）、兔抗大鼠 Caspr（1∶300，Abcam）、抗兔和抗小鼠熒光二抗（1:500，CST）。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用Graphpad Prism 7進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)以x±s表示。水迷宮逃逸潛伏期使用重復(fù)測量設(shè)計方差分析，其余數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布及方差齊性情況下組間比較使用t檢驗。，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1死亡率假手術(shù)組9只大鼠全部存活，RHRSP/2VO組9只大鼠收縮壓均達180 mmHg以上，3只大鼠在雙側(cè)頸總動脈夾閉后1 d死亡，其余6只RHRSP/2VO組大鼠存活。

圖1 水迷宮結(jié)果逃逸潛伏期和穿越平臺次數(shù)。A為定位航行試驗逃避潛伏期；B為空間探索試驗穿越平臺次數(shù)；*表示與假手術(shù)組相比，P＜0.05

2.2 Morris水迷宮實驗結(jié)果定位航行實驗表明在雙側(cè)頸總動脈夾閉術(shù)后第12周手術(shù)組與假手術(shù)組逃逸潛伏期均逐漸下降，第1、2天手術(shù)組和假手術(shù)組逃逸潛伏期無統(tǒng)計學(xué)差異，第3～5天手術(shù)組和假手術(shù)組逃逸潛伏期有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；第6天手術(shù)組穿越平臺次數(shù)（2.33±0.76,n=6）較假手術(shù)組（5.56±0.63,n=9）減少，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 HE染色手術(shù)組在雙側(cè)頸總動脈夾閉術(shù)后第12周后觀察到腦內(nèi)高血壓性小動脈硬化、玻璃樣變；假手術(shù)組小動脈無內(nèi)膜增厚、無管腔狹窄。

2.4 LFB染色手術(shù)組在雙側(cè)頸總動脈夾閉術(shù)后第12周后觀察到側(cè)腦室旁雙側(cè)胼胝體出現(xiàn)髓鞘條索狀脫失紊亂、形成空泡；假手術(shù)組在同一時間點同一部位的胼胝體纖維排列緊密有序。

圖2 病變部位 HE、LFB、MBP免疫組化結(jié)果（400×）。圖A為手術(shù)組大腦切片HE染色圖，黑色箭指小動脈硬化、內(nèi)膜增厚、玻璃樣變；圖B為假手術(shù)組大腦切片HE染色，白色箭指正常的小動脈。圖C為手術(shù)組胼胝體出現(xiàn)條索狀、空泡狀脫髓鞘改變（黑色箭）；圖D為假手術(shù)組胼胝體髓鞘緊密排列，無脫失。圖E為手術(shù)組胼胝體出現(xiàn)條索狀、空泡狀脫髓鞘改變（黑色箭）；圖F為假手術(shù)組胼胝體染色均勻。Bar=50μm

圖3 少突膠質(zhì)細胞免疫熒光染色（200×）。對比假手術(shù)組，手術(shù)組胼胝體病變部位少突膠質(zhì)細胞明顯減少。Bar=100 μm

圖4 Caspr免疫熒光染色 （1000×）圖A是手術(shù)組腦白質(zhì)病變部位；圖B是假手術(shù)組對應(yīng)部位；圖C、D、E是手術(shù)組腦白質(zhì)病變病灶周圍髓鞘正常區(qū)域；圖F是兩組郎飛結(jié)長度統(tǒng)計圖；圖C中放大區(qū)域可見郎飛結(jié)長度增加。Caspr代表郎飛結(jié)結(jié)側(cè)區(qū)，相鄰結(jié)側(cè)區(qū)之間的間隙為郎飛結(jié)長度；白色星號指直徑增粗的結(jié)側(cè)區(qū),白色箭頭指病態(tài)延長的結(jié)側(cè)區(qū)；*表示與假手術(shù)組相比，P＜0.05。Bar=10 μm

2.5 MBP免疫組化染色手術(shù)組免疫組化染色出現(xiàn)胼胝體纖維紊亂，出現(xiàn)空泡；假手術(shù)組胼胝體染色均勻。纖維排列緊密。

2.6免疫熒光染色少突膠質(zhì)細胞免疫熒光染色顯示：相對假手術(shù)組，手術(shù)組頸總動脈夾閉術(shù)后第12周胼胝體病變區(qū)域少突膠質(zhì)細胞減少；結(jié)側(cè)區(qū)特異性蛋白-Caspr免疫熒光染色顯示：手術(shù)組術(shù)后第12周胼胝體白質(zhì)纖維軸索結(jié)側(cè)區(qū)缺失，對照組假手術(shù)后第12周相應(yīng)部位結(jié)側(cè)區(qū)規(guī)則排列；手術(shù)組術(shù)后第12周胼胝體脫髓鞘部位的周圍髓鞘正常的白質(zhì)區(qū)域纖維軸索郎飛結(jié)長度增加 （P＜0.05）、結(jié)側(cè)區(qū)直徑增粗、長度延長。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)正常腦白質(zhì)富含排列規(guī)則的Caspr,而RHRSP-2VO模型除了具有典型的腦白質(zhì)脫髓鞘及小動脈硬化的病理改變，還存在病變區(qū)域Caspr表達明顯減少，病變周圍髓鞘正常區(qū)域郎飛結(jié)和結(jié)側(cè)區(qū)長度增加、結(jié)側(cè)區(qū)增粗的異常病理改變，說明腦白質(zhì)病變是髓鞘和軸索共同損傷的過程。

郎飛結(jié)兩側(cè)的結(jié)側(cè)區(qū)是軸索與少突膠質(zhì)細胞相互作用的關(guān)鍵部位，主要通過三種黏附分子（軸索上的接觸蛋白、Caspr、膠質(zhì)細胞神經(jīng)束蛋白-155）相互作用形成復(fù)合體，該區(qū)域?qū)a+、K+的高度聚集和分隔起重要作用[9,12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)病變部位Caspr表達減少并且排列紊亂，說明慢性腦白質(zhì)病變不僅僅是單純的髓鞘丟失，還存在軸索結(jié)側(cè)區(qū)結(jié)構(gòu)和功能的破壞。結(jié)側(cè)區(qū)作為軸索重要組成部分，從功能上說，一方面，結(jié)側(cè)區(qū)是少突膠質(zhì)細胞髓鞘成環(huán)包繞軸索的關(guān)鍵部位，該部位Caspr的缺失將影響軸索和少突膠質(zhì)細胞的相互作用從而導(dǎo)致髓鞘不能形成[14-15]，這可能與少突膠質(zhì)細胞功能紊亂及數(shù)量減少有關(guān)；另一方面，結(jié)側(cè)區(qū)作為屏障分隔郎飛結(jié)區(qū)的Na+通道和近結(jié)側(cè)區(qū)的K+通道[9]，結(jié)側(cè)區(qū)的缺失間接破壞了Na+的高度聚集狀態(tài)，阻礙了局部電位形成，繼而降低有髓神經(jīng)纖維跳躍式傳導(dǎo)效率。因此，髓鞘丟失和結(jié)側(cè)區(qū)結(jié)構(gòu)異常是腦白質(zhì)病變的重要病理基礎(chǔ)，共同降低了中樞神經(jīng)系統(tǒng)有髓神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)效率，繼而影響了認知功能。

郎飛結(jié)是有髓神經(jīng)纖維的重要結(jié)構(gòu)，含有高度聚集的Na+通道[16]，本研究中病變周圍尚未脫髓鞘部位出現(xiàn)的郎飛結(jié)的病態(tài)伸長，降低了Na+的平均密度，直接破壞了郎飛結(jié)處Na+高度聚集狀態(tài)，繼而降低了郎飛結(jié)跳躍式傳導(dǎo)的效率。從另一個角度來說，這些髓鞘正常部位的軸索損傷可能早于髓鞘脫失，那么軸索損傷是否在整個腦白質(zhì)病變之前就已經(jīng)出現(xiàn)，這種預(yù)測價值需要更多的實驗來探究。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)病變周圍未脫髓鞘部位的結(jié)側(cè)區(qū)異常增粗與病態(tài)伸長，許多關(guān)于多發(fā)性硬化的研究表明，結(jié)側(cè)區(qū)的增粗和延長是髓鞘脫失的預(yù)測信號[17]，那么在RHRSP-2VO模型中，結(jié)側(cè)區(qū)的結(jié)構(gòu)異常是否是腦白質(zhì)慢性脫髓鞘的預(yù)測信號，其中的機制需要在疾病發(fā)生早期進一步研究。腦白質(zhì)病變患者臨床表現(xiàn)無特異性，而且患者的臨床癥狀往往與其影像學(xué)顯示的病變性質(zhì)和嚴(yán)重程度不一致[18]，單從局部病變區(qū)域的脫髓鞘改變無法合理解釋嚴(yán)重的臨床癥狀，這可能是由于目前無法從常規(guī)影像學(xué)觀察到脫髓鞘病灶周圍潛在的軸索損傷，另外這些軸索微結(jié)構(gòu)損傷可能擴散到周邊或遠隔腦區(qū)，擾亂腦網(wǎng)絡(luò)的連接，影響全腦的有效通信繼而引起認知減退、步態(tài)異常和自主神經(jīng)功能紊亂等表現(xiàn)[19]。本實驗的不足之處在于未能在更多的時間點和用多個不同指標(biāo)全面評價軸索病理改變，軸索損傷及與腦白質(zhì)病變的先后關(guān)系與機制需要進一步研究。

總而言之，慢性腦白質(zhì)病變不僅有髓鞘丟失，同時還存在軸索損傷。軸索損傷可能是腦白質(zhì)病變的潛在機制，軸索損傷的修復(fù)將是臨床腦白質(zhì)病變治療的新領(lǐng)域。