李彬 羅永杰○☆ 羅蕓 汪溯

亨廷頓?。℉untington disease，HD）是一種常染色體顯性遺傳的變性疾病，通常發(fā)病年齡在30～50歲。典型癥狀包括進(jìn)行性加重的舞蹈樣癥狀、認(rèn)知和精神障礙。致病基因IT15位于染色體4p16.3中，其外顯子1上的CAG重復(fù)次數(shù)與發(fā)病密切相關(guān)[1]。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)（CAG）n≥40時(shí)患者必然會(huì)患??；（CAG）n為 36～39時(shí)仍可發(fā)病，但外顯率降低，患者癥狀可能較輕；（CAG）n為 27～35時(shí)不發(fā)病，但其后代出現(xiàn)擴(kuò)增突變的風(fēng)險(xiǎn)增加;（CAG）n＜27次為正常范圍[2]。最近一個(gè)薈萃分析顯示中國(guó)/日本HD患病率為0.40/10萬，而歐洲/北美以及大洋洲患病率為5.7/10萬[3]。本研究中，我們收集了來自四川的4個(gè)亨廷頓病家系，采用DNA直接測(cè)序方法檢測(cè)IT15基因，并分析家系及臨床特點(diǎn)，為HD家系成員提供遺傳咨詢。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象連續(xù)收集2016年3月至2018年3月至四川省人民醫(yī)院就診的亨廷頓病患者及部分家系成員的詳細(xì)臨床資料。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)亨廷頓病的診斷與治療指南[4]，結(jié)合陽性家族史、特征性的運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知和精神癥狀作出臨床診斷，如無陽性家族史，或癥狀不典型可通過基因測(cè)試而確診。本研究納入的4個(gè)HD家系均來自四川地區(qū)，共有24例參加IT15基因測(cè)序，其中男14例，女10例，年齡分布在 7～76 歲，平均年齡為（32.75±17.62）歲。本研究獲得所有受試者的同意并通過了四川省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核。

1.2資料收集亨廷頓病患者及家系成員進(jìn)行詳細(xì)病史資料采集，包括基本信息采集，病史采集，體格檢查，認(rèn)知功能評(píng)估（MMSE、MoCA），焦慮抑郁評(píng)估（HAMA、HAMD），日常生活能力評(píng)估（ADL）等，并繪制系譜圖。

1.3基因檢測(cè)

1.3.1基因組 DNA提取 采集外周靜脈血5 mL，采用天根?血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒（DP304）提取基因組DNA。提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。

1.3.2引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)IT5基因序列設(shè)計(jì)熒光修飾引物，上游引物序列（HTT-F）：GCCTCCG GGGACTGCCGT；下游引物序列（HTT-R）：GTGG CGGCTGTTGCTGCT，熒光修飾引物標(biāo)記類型為FAM。熒光修飾引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.3.3PCR 擴(kuò)增 ①采用 TSINGKE?2×T5 Super PCR Mix對(duì)樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。②反應(yīng)體系為 T5 Mix 15 μL， HTT-F（10P） 0.5 μL，HTT-R（10P）0.5 μL，gDNA 1 μL，ddH2O 13 μL。 ③應(yīng)用 9700 型自動(dòng)擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為預(yù)變性98℃，3 min，（98℃，10 s；57℃，15 s；72℃，10 s）為1個(gè)循環(huán)，共 35個(gè)循環(huán)，最后 72℃，延伸 5 min，4℃保存。

1.3.4定量稀釋 將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取 2 μL進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA 20 min電泳觀察，根據(jù)條帶亮度定量稀釋PCR產(chǎn)物。

1.3.5上機(jī)檢測(cè) 稀釋后的PCR產(chǎn)物與內(nèi)標(biāo)500 LIZ混合后上ABI 3730XL DNA測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0對(duì)符合正態(tài)分布的雙變量進(jìn)行Pearson直線相關(guān)分析，不符合正態(tài)分布的雙變量進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1人口學(xué)資料與基因檢測(cè)通過基因檢測(cè)，確診8例HD患者，其中男6例，女2例，發(fā)病年齡在23～57歲，病程1～31年，CAG長(zhǎng)鏈重復(fù)次數(shù)41～54次。發(fā)現(xiàn)癥狀前患者7例，其中男5例，女2例，年齡7～47歲，CAG長(zhǎng)鏈重復(fù)次數(shù)43～58次。詳見表1。

2.2部分成員PCR擴(kuò)增家系A(chǔ)先證者Ⅲa10的IT15基因出現(xiàn)異常擴(kuò)增，正常等位基因?qū)?yīng)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為149 bp，異常等位基因?qū)?yīng)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為239 bp（圖1A）；先證者的兒子Ⅳa9同樣出現(xiàn)了異常擴(kuò)增，其對(duì)應(yīng)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為269 bp（圖1B）。家系C中先證者Ⅲc5異常等位基因?qū)?yīng)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為257 bp（圖1C）。Ⅲa18未出現(xiàn)擴(kuò)增，兩條等位基因?qū)?yīng)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為146 bp、155 bp（圖 1D）。

2.3家系系譜分析家系A(chǔ)有5代，共有患者7例，其中男5例，女2例。4例現(xiàn)癥患者，均為男性；發(fā)現(xiàn)6例癥狀前患者，男5例，女1例。在家系傳代過程中，第一代發(fā)病年齡為50歲，第二代平均起病年齡40歲左右，第三代平均起病年齡36歲左右。家系B有5代，共有患者7例，其中男4例，女3例。2例現(xiàn)癥患者，1例育齡期癥狀前患者。家系C有4代，共4例患者，男1例，女3例。家系C中第一代起病年齡為40歲，第二代平均起病年齡33歲左右，第三代起病年齡23歲。家系D無家族病史，先證者父母于60歲左右死于惡性腫瘤，其余家系成員目前尚未出現(xiàn)舞蹈樣癥狀。上述家系A(chǔ)和C在傳代過程中均出現(xiàn)遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象。

表1家系成員基本資料

圖1部分人員PCR擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳結(jié)果

2.4現(xiàn)癥HD患者臨床特點(diǎn)家系A(chǔ)中先證者（Ⅲa10）44歲，男，36歲時(shí)出現(xiàn)雙上肢及面部不自主運(yùn)動(dòng)，伴有聳肩動(dòng)作，吐詞欠清，并有焦慮、失眠等；其弟弟（Ⅲa14）癥狀較輕微，但小舅（Ⅱa14）、大舅（Ⅱa1）病程較長(zhǎng)，舞蹈樣癥狀更嚴(yán)重、認(rèn)知功能下降更明顯。家系B中先證者（Ⅲb2）52歲，女，44歲出現(xiàn)雙下肢不自主運(yùn)動(dòng)，后逐漸發(fā)展至全身，有明顯認(rèn)知障礙，家屬訴及患者早期有性格改變，易激惹。家系C中先證者（Ⅲc5）23歲，男，22歲時(shí)出現(xiàn)肢體不自主運(yùn)動(dòng)，以手指撥動(dòng)及肩部不自主運(yùn)動(dòng)為主，目前癥狀較輕，其三姨（Ⅱc5）有明顯舞蹈樣癥狀及認(rèn)知功能下降。家系D中先證者（Ⅱd1）59歲，男，57歲時(shí)以行走不穩(wěn)起病，逐漸出現(xiàn)舞蹈樣不自主運(yùn)動(dòng)及言語含糊，進(jìn)行性加重。直線相關(guān)分析顯示：CAG重復(fù)次數(shù)與發(fā)病年齡成負(fù)相關(guān) （r=-0.967，P＜0.01）。 秩相關(guān)分析顯示：ADL評(píng)分與病程（r=0.842,P＜0.01）呈正相關(guān)，與MMSE評(píng)分 （r=-0.930,P＜0.01）、MoCA 評(píng)分 （r=-0.932,P＜0.01）呈負(fù)相關(guān)。

2.5影像學(xué)家系A(chǔ)中先證者（Ⅲa10）44歲，頭顱CT可見彌漫大腦皮層萎縮，外側(cè)裂池增寬，特征性雙側(cè)尾狀核萎縮（圖3a）。家系C中先證者（Ⅲc5）24歲，病程僅1年，頭顱MRI尚未出現(xiàn)明顯的異常（圖 3b，T2WI）。 家系 D 中先證者（Ⅱd1），59歲，頭顱MRI表現(xiàn)為明顯的側(cè)腦室增寬、大腦皮層萎縮（圖 3c、d，T2WI），亦可見雙側(cè)尾狀核及殼核的萎縮（圖 3c，T2WI）。

3 討論

圖2 4個(gè)HD家系系譜圖（右上角標(biāo)*為本次參加基因檢測(cè)的成員）

表2 HD患者及部分癥狀前HD患者的臨床特點(diǎn)

圖3 部分先證者的頭顱影像學(xué)表現(xiàn)

本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)病年齡與CAG重復(fù)次數(shù)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.967，P＜0.01），與 KEUM、LEE 等[5-6]的發(fā)現(xiàn)一致，由此我們可以推測(cè)家系A(chǔ)中Ⅳa9、Ⅳa12、Ⅳa13的發(fā)病年齡可能較早。雖然CAG重復(fù)數(shù)對(duì)發(fā)病年齡起主導(dǎo)作用，但仍受修飾基因或環(huán)境因素影響[6]。家系A(chǔ)中先證者及其弟弟、表弟（Ⅲa10、Ⅲa14、Ⅲa16）的 CAG 重復(fù)次數(shù)分別為 48、48、50 次，他們各自子女（Ⅳa9、Ⅳa12、Ⅳa13）的CAG重復(fù)數(shù)分別為58、58、52次，都出現(xiàn)了擴(kuò)增的情況，與WHEELER等[7]發(fā)現(xiàn)后代從父系遺傳的CAG拷貝數(shù)更傾向于擴(kuò)增這一研究一致。但家系B中先證者（Ⅲb2）到女兒（Ⅳb3）的母系遺傳過程中也出現(xiàn)了2個(gè)拷貝數(shù)的擴(kuò)增。目前所研究的家系的傳代過程中尚未發(fā)現(xiàn)CAG縮減情況。

經(jīng)過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，ADL評(píng)分與病程 （r=0.842,P＜0.01）呈正相關(guān)，與 MMSE 評(píng)分（r=-0.930,P＜0.01）、MoCA 評(píng)分 （r=-0.932,P＜0.01） 呈負(fù)相關(guān)。這與亨廷頓病疾病進(jìn)展是一致的，晚期病人臨床癥狀較重，認(rèn)知功能也明顯下降，日常生活能力進(jìn)一步下降。如家系A(chǔ)中Ⅱa1、Ⅱa14及家系B中的Ⅲb2病程較長(zhǎng)，目前生活均無法自理。HD患者認(rèn)知功能障礙可早于運(yùn)動(dòng)障礙數(shù)年出現(xiàn)，主要出現(xiàn)執(zhí)行功能、注意力、記憶、學(xué)習(xí)、處理速度、自知力等方面的認(rèn)知功能下降[8]。MMSE常用來評(píng)估HD患者認(rèn)知功能，但MICKES等[9]發(fā)現(xiàn)MoCA在HD相關(guān)的認(rèn)知功能障礙檢測(cè)較MMSE更敏感，這與我們的發(fā)現(xiàn)一致。家系A(chǔ)中Ⅲa2、Ⅲa10的MMSE評(píng)分正常，但MoCA評(píng)分提示認(rèn)知功能是下降的。

目前報(bào)道的HD患者及癥狀前患者中有10%～80%的不同程度抑郁的風(fēng)險(xiǎn)[10-11]，焦慮的患病率在13%～71%的范圍[10,12-14]。我們發(fā)現(xiàn)參與者中焦慮抑郁發(fā)生率均較高。焦慮抑郁可出現(xiàn)在HD病程中的任何階段，在病程進(jìn)展與焦慮抑郁的關(guān)系研究中，目前尚無一致結(jié)論[14-17]。部分人在接受基因測(cè)試時(shí)的焦慮抑郁水平最高[18-19]，如Ⅳa9、Ⅳb3有較嚴(yán)重的焦慮抑郁，可能是因?yàn)榛疾〖彝ブ械哪贻p一代必須面對(duì)遺傳風(fēng)險(xiǎn)、婚育、家庭負(fù)擔(dān)及社會(huì)歧視等方面的問題[20]。

家系D中先證者（Ⅱd1）57歲起病，發(fā)病較晚，與LIPE[21]的研究中晚發(fā)型HD很類似?；颊哳^顱MRI（圖3c、圖3d）及核素腦池顯像提示交通性腦積水，既往多篇報(bào)道[22-24]的晚發(fā)型亨廷頓病被誤診為正常壓力腦積水，后經(jīng)基因檢測(cè)才被確診。該家系無家族史，先證者父母均于60多歲時(shí)死于惡性腫瘤，不排除其死亡時(shí)尚未出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)癥狀的情況，但也可能父母其中一人的CAG重復(fù)數(shù)在27～35的范圍[25]，在傳代的過程中導(dǎo)致CAG擴(kuò)增。建議先證者兒子及其他直系親屬進(jìn)一步行基因檢測(cè)。

目前沒有任何藥物可以阻止、減緩或逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展。家系A(chǔ)、B、D中先證者曾予以鹽酸硫必利、氟哌啶醇改善舞蹈癥狀，余患者均未接受對(duì)癥治療。本研究中有1例HD患者和3例癥狀前患者近期有生育需要，但其有50%的風(fēng)險(xiǎn)將致病基因傳給下一代，所以遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷是非常必要的。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，無創(chuàng)的產(chǎn)前診斷[26]或許能為亨廷頓病家系帶來福音，從根源上避免患兒的出生。

綜上，IT15基因的檢測(cè)對(duì)于亨廷頓病的確診及癥狀前診斷具有重要的意義，特別是對(duì)家族史陰性及發(fā)病晚的癥狀不典型的患者。CAG重復(fù)次數(shù)在一定程度上能夠預(yù)測(cè)發(fā)病年齡的早晚，本研究中的家系均來自四川地區(qū)，與JIANG等[27]研究中國(guó)人的CAG重復(fù)次數(shù)以及與發(fā)病年齡的相關(guān)性上的發(fā)現(xiàn)是一致的。家系傳代過程中存在CAG重復(fù)次數(shù)的擴(kuò)增,且有遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象。目前尚無特異的治療方法，所以遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷是非常必要的。