張沙沙 曹葉偉 李 姣 朱肖翔 劉亞洲 姜靜雨

（西藏自治區(qū)食品藥品檢驗研究院 西藏拉薩 850000）

1 前言

紅景天是景天科多年生草本植物，主要分布在西藏、東北、新疆、四川等省份，是一種藥食兼用植物，常以根莖入藥[1]。研究表明紅景天具有預(yù)防腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗疲勞及緩解壓力、抗缺氧[2]、抗病毒[3-5]等功效。其主要功能成分為紅景天苷[6]。近年來，以紅景天苷為主要功效成分開發(fā)的產(chǎn)品主要包括紅景天保健品及中成藥、紅景天飲料、紅景天發(fā)酵食品[1]等。目前，對紅景天及其產(chǎn)品中紅景天苷的提取方法主要包括超聲輔助水提、乙醇提及甲醇提[7-8]等，近年來，有學(xué)者通過相關(guān)研究證明使用一定比例甲醇水提取時，提取率最高[9]。紅景天苷的測定方法主要有高效液相色譜法[10]、比色法[11]、薄層掃描法等[12]，相比于其他方法，高效液相色譜法能更有效地分離出目標(biāo)物中的紅景天苷，避免紅景天中其他干擾物質(zhì)對結(jié)果的影響[13]，且前處理簡單，分析速度快，應(yīng)用范圍廣，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高。西藏紅景天飲料主要以紅景天的粗浸提液調(diào)配制成[14]，質(zhì)地稍渾濁，有少許紅景天根莖沉淀，使用保健食品產(chǎn)品技術(shù)要求中規(guī)定的飲料中紅景天苷測定方法難以將該飲料中紅景天苷充分提取出來，從而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了解決上述難題，本研究通過單因素對比試驗與響應(yīng)面試驗設(shè)計確定了高效液相色譜法測定紅景天飲料中紅景天苷的提取試劑、提取時間、提取溫度及最佳流動相，建立了西藏紅景天飲料中紅景天苷測定的高效液相色譜方法。

2 材料與儀器

2.1 材料

紅景天飲料（西藏屋脊之寶生物科技有限公司生產(chǎn)）；甲醇（色譜級，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；怡寶純凈水（華潤怡寶飲料（中國）有限公司）。

2.2 實驗儀器

超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；臺式高速離心機(jī)（美國賽默飛世爾科技有限公司）；高效液相色譜儀（配有PDA檢測器，島津企業(yè)管理 （中國）有限公司）；安捷倫C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，安捷倫科技（中國）有限公司）。

2.3 單因素實驗設(shè)計

準(zhǔn)確吸取10.0 mL充分混勻后的紅景天飲料，加入適量溶劑，超聲提取后定容、離心，使用0.45μm有機(jī)濾膜過濾后，通過高效液相色譜儀測定紅景天苷含量。首先，通過單因素對比試驗確定最佳流動相，再考察提取溶劑比例、提取時間與溫度對測定結(jié)果的影響。

2.4 響應(yīng)面的組合試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，確定以提取試劑比例（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）3 個因素為自變量，以目標(biāo)峰（紅景天苷）面積為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析對紅景天苷的測定條件進(jìn)行充分優(yōu)化。試驗因素和水平見表1。

表1 紅景天苷測定試驗的因素與水平

3 方法與結(jié)果分析

3.1 最佳流動相的確定

安捷倫 C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，檢測波長215 nm，進(jìn)樣量10 μL，總流速為1 mL/min，分別以20%、40%、60%的甲醇水溶液（V/V）作為流動相進(jìn)行等度洗脫，測定同一濃度紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品和同一樣品，通過紅景天苷出峰情況和峰面積大小，確定最佳流動相。詳見圖1～圖3及表2。

圖1 流動相為20%甲醇水溶液（V/V）時的紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖

圖2 流動相為40%甲醇水溶液（V/V）時的紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖

圖3 流動相為60%甲醇水溶液（V/V）時的紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖

表2 紅景天苷在不同流動相下的出峰情況

由圖1可以看出，當(dāng)流動相為20%甲醇水溶液（V/V）時，紅景天苷與其他雜峰的分離效果較好，且峰形較為理想，由圖2～圖3可以看出，當(dāng)流動相分別為40%、60%甲醇水溶液（V/V）時，紅景天苷與其他雜峰的分離效果差。結(jié)合表2可看出，紅景天苷隨著流動相中甲醇濃度的增高，出峰時間雖在逐步提前，但峰面積在逐步減小。綜上分析可知，紅景天苷的最佳流動相為20%甲醇水溶液（V/V）。

3.2 提取溶劑的確定

取50 mL容量瓶5只并編號，吸取20 mL混勻后的樣液于各容量瓶中，分別加入0%、25%、50%、75%、100%的甲醇水溶液（V/V）超聲提取20 min后，過濾，上機(jī)，確定最佳紅景天苷提取溶劑。

圖4 提取溶劑對紅景天苷峰面積的影響

由圖4可以看出，以甲醇水溶液作為提取溶劑對樣品進(jìn)行處理時，甲醇含量在0%～50%，隨著甲醇含量的增大，紅景天苷面積也隨之增大，當(dāng)甲醇含量為50%時達(dá)到最大，隨后，隨著甲醇濃度的持續(xù)增大，紅景天苷峰面積反而在減小，但減小幅度緩慢，因此，確定以50%甲醇水溶液（V/V）作為樣品的提取溶劑。

3.3 超聲提取時間的確定

取50 mL容量瓶7只并編號，吸取20 mL搖勻后的樣液于各容量瓶中，加入50%甲醇水溶液（V/V），以 0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min分別對其超聲提取后，過濾，上機(jī)，確定樣品的最佳超聲提取時間。

圖5 超聲時間對紅景天苷峰面積的影響

由圖5可以看出，樣品的超聲提取時間在0～20min之間時，紅景天苷峰面積呈上升趨勢，在20 min時達(dá)到最大，隨后，提取時間繼續(xù)增加，紅景天苷峰面積的增長幅度基本趨于平穩(wěn)。因此，確定樣品的最佳超聲提取時間為20 min。

3.4 超聲提取溫度的確定

取50 mL容量瓶5只并編號，吸取20 mL搖勻后的樣液于各只容量瓶中，加入50%甲醇水溶液（V/V），以 25、35、45、55、65℃分別對其超聲提取 20 min 后，過濾，上機(jī)，確定樣品的最佳超聲提取時間。

圖6 超聲溫度對紅景天苷峰面積的影響

由圖6可以看出，樣液的提取溫度在0～45℃時，紅景天苷峰面積在逐步增大，表明飲料中紅景天苷的提取量也逐漸增大，隨著提取溫度的持續(xù)增加，紅景天苷的提取量反而在緩慢減小。因此，樣品的提取溫度選擇45℃。

3.5 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

根據(jù)表3的試驗數(shù)據(jù)，利用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行設(shè)計分析，得出了3個因素和目標(biāo)峰面積之間的回歸方程為：

表3 樣品中紅景天苷的提取條件響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

由表4 可看出，在此模型中，0.0001＞P＞F，表明模型回歸極顯著；失擬項不顯著，說明試驗數(shù)據(jù)與模型擬合度良好，通過對上述模型分析得出，各因素都極顯著，說明各試驗因子與響應(yīng)面的關(guān)系中，因變量和全體自變量的關(guān)系顯著，r2=0.9973，這充分說明響應(yīng)面的變化有99.73%來源于所選的變量 （提取溶劑、提取時間、提取溫度）。綜上分析，回歸模型的擬合度良好，可利用該回歸方程對樣品中紅景天苷的提取條件進(jìn)行分析和優(yōu)化。

表4 方差分析表

應(yīng)用BOX-Behnken分析計算，得出樣液中紅景天苷最佳提取條件為：提取溶劑為50%甲醇水溶液（V/V）、超聲提取時間與溫度分別為 20 min、45℃，預(yù)測紅景天苷的峰面積為310145。在此條件下進(jìn)行6次重復(fù)性試驗，紅景天苷的平均面積為309 697，與預(yù)測值得誤差為1.4%，小于5%，預(yù)測值與試驗值之間的擬合度良好，表明采用BOX-Behnken試驗設(shè)計所得的樣品中紅景天苷的最佳提取條件可行。

3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和供試樣液的制備

精密稱取純度為98.8%的紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品8.0162mg于20 mL容量瓶中，用甲醇定容刻度，即得紅景天苷濃度為0.396 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，再分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液 30 μL、65 μL、150 μL、300 μL、650 μL，以50%（V/V）甲醇水溶液稀釋成濃度為0.01188、0.02574、0.0594、0.1188、0.2574 mg/mL 的溶液，上機(jī)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確吸取樣液于容量瓶中，加入50%甲醇水溶液（V/V）后，以45℃超聲提取20 min后，再以50%甲醇水溶液（V/V）定容至刻度，混勻，以3 000 r/min離心3 min后，經(jīng)0.45 μm有機(jī)系濾膜過濾，上機(jī)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中紅景天苷的含量。

由圖7可知，紅景天苷含量在0.01188～0.2574mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)線性方程為y=1E+07X+7986，r2=0.9999。

圖7 紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.7 精密度實驗

將濃度為 0.01188mg/mL、0.0594mg/mL、0.2574mg/mL的紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品在上述色譜條件下，分別連續(xù)進(jìn)針6次，測得的紅景天苷面積與精密度如表5所示，各濃度進(jìn)針6次所得峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于5%，這表明優(yōu)化后的實驗方法精密度良好。

表5 精密度實驗結(jié)果表

3.8 重現(xiàn)性試驗

選取同一樣品，按照2.6方法制備6份供試液，在上述色譜條件下，進(jìn)樣，所測得的紅景天苷濃度分別為0.0240mg/mL、0.0250mg/mL、0.0250mg/mL、0.0240mg/mL、0.0250mg/mL、0.0240mg/mL，平均值為 0.0245 mg/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.05%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

3.9 加標(biāo)回收試驗

精確吸取同一樣液9份于容量瓶中，每份吸取體積為20 mL，加入不同濃度紅景天苷對照品溶液，并以50%甲醇水溶液（V/V）定容至刻度，按照2.6方法制備供試溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測定紅景天苷含量，計算加標(biāo)回收率，驗證評價方法的準(zhǔn)確性。

表6 加標(biāo)回收實驗表

由表6可知，向樣品溶液中所加的3個濃度水平紅景天苷對照品的回收率都不小于90%，平均回收率為95.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%，小于1.5%，回收率良好，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

4 結(jié)論

本研究通過對比試驗得到紅景天苷的最佳色譜條件為：柱溫30℃、檢測波長215 nm、進(jìn)樣量10 μL、流速1.0 mL/min，流動相為20%甲醇水溶液（V/V）。采用BOX-Behnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法得到紅景天飲料中紅景天苷的最佳提取條件為：提取溶劑為50%甲醇水溶液（V/V）、提取時間與溫度分別為20 min與45℃。經(jīng)外標(biāo)定量法驗證后發(fā)現(xiàn)：該測定方法不僅準(zhǔn)確度高，且加標(biāo)回收率良好，適用于今后紅景天類食品及保健品中功效成分的測定。