梁穎婕 冼鈺茵 劉婧文 黃成棟 奚星林 凌莉*

（1.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 廣東廣州 510623；2.廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

1 前言

咖啡是全球最受歡迎的食品之一，為世界三大飲料之首，是國際貿(mào)易中十分重要的原料產(chǎn)品，主要有阿拉比卡和羅布斯塔兩個(gè)品種[1]。在供不應(yīng)求的情況下，不法商人為有利可圖而在咖啡中摻入玉米、大麥、小麥、大豆、大米等物質(zhì)[2]。目前，鑒別咖啡的方法有物理法[3]、化學(xué)法[4,5]、色譜質(zhì)譜法[6]、光譜法[7]和分子生物法[8]等。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基于DNA的物種鑒別方法（如PCR技術(shù)等）已發(fā)展成為分析化學(xué)技術(shù)的有效補(bǔ)充方法，它具有方便、準(zhǔn)確、迅速、簡潔的特點(diǎn)，越來越多地應(yīng)用于咖啡檢測(cè)中[9,10]。Ferreira等[11]設(shè)計(jì)了咖啡的特異性引物對(duì)，用實(shí)時(shí)熒光PCR染料法檢測(cè)咖啡成分。

實(shí)時(shí)熒光PCR探針法也是一種快速鑒別物種的方法，而迄今為止，未有相關(guān)研究使用探針法快速鑒別咖啡物種。本實(shí)驗(yàn)旨在設(shè)計(jì)出咖啡的物種特異性引物與探針，建立一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)咖啡成分的方法。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)的咖啡樣品見表1，購自廣州各大超市；黃豆、黑豆、綠豆、紅豆、眉豆、花生、小米、蕎麥、小麥、玉米、蘋果、梨、橙子、紅棗、核桃、木瓜、甜菜、大米、米粉、雞、鵝、水鴨、水牛、綿羊、豬、馬、家兔、羅非魚、牡蠣、蝦均購自廣州永旺超市；SD大鼠、轉(zhuǎn)基因大豆來自本實(shí)驗(yàn)室，用于咖啡的特異性檢測(cè)。

QuickGene DNA tissue kit S，日本KURABO公司；Wizard Genomic DNA Purification Kit，Promega公司；MagDEADNA200 （GC）， 日本 PSS公司；Takara Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)，寶生物工程（大連）有限公司。

2.2 主要儀器與設(shè)備

表1 實(shí)驗(yàn)咖啡樣品

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 DNA提取與制備

將2.1提到的樣品用研磨機(jī)或攪拌機(jī)均質(zhì)研磨成粉狀或肉碎狀。使用2.2中的3種DNA提取試劑盒提取咖啡樣品的基因組DNA，其余陰性對(duì)照樣品用Magtration12GC PLUS核酸提取儀搭配MagDEADNA200（GC）試劑盒提取。提取方法詳見試劑盒操作說明書。使用Nano核酸蛋白含量測(cè)定儀測(cè)定基因組DNA的濃度。用1×TE緩沖液作系列稀釋，使咖啡 DNA 濃度為 10.00 ng/μL、5.00 ng/μL、1.00 ng/μL、0.50 ng/μL、0.10 ng/μL、0.01 ng/μL。用非咖啡物種的DNA （大豆DNA）梯度稀釋咖啡DNA，得到10.00% 、1.00% 、0.10% 、0.01% 的 DNA 溶 液 。25 μL體系內(nèi)加1 μL的DNA，用于進(jìn)行DNA檢測(cè)靈敏度檢測(cè)。

2.3.2 引物及探針的設(shè)計(jì)與合成

本研究參考Denoeud F對(duì)咖啡基因組的分析[12]，通過在NCBI數(shù)據(jù)庫上反復(fù)尋找篩選，找到了咖啡的黃苷甲基轉(zhuǎn)移酶（Xanthosine Methyltransferase 1，XMT1）基因（Gene Bank:JX978514.1 和 JX978509.1）上的特異性片段，使用軟件Primer Express設(shè)計(jì)出引物和探針，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物為PAGE級(jí)，探針為HPLC級(jí)。咖啡引物和探針序列分別為：

2.3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)

實(shí)時(shí)熒光 PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：2×PCR Premix Extaq 12.5 μL，引物（10 μmol/L）及探針（10 μmol/L）各 1μL，參比熒光 ROX（50×）0.5 μL，模板 DNA 1 μL，用 ddH2O 補(bǔ)足體系。擴(kuò)增條件為：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s，共 40 個(gè)循環(huán)。

3 結(jié)果

3.1 咖啡引物與探針XMT1-F/XMT1-R/XMT1-P的特異性驗(yàn)證

按照2.3的方法，用咖啡引物與探針XMT1-F/XMT1-R/XMT1-P擴(kuò)增C1～C7編號(hào)的咖啡豆和其他非咖啡樣品，進(jìn)行咖啡引物與探針的特異性驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，本套引物與探針對(duì)7種咖啡豆的DNA均有明顯的擴(kuò)增，對(duì)其他糧食作物、禽類、海鮮和哺乳類動(dòng)物都無明顯擴(kuò)增，說明咖啡引物與探針XMT1-F/XMT1-R/XMT1-P具有物種特異性。

3.2 咖啡引物與探針XMT1-F/XMT1-R/XMT1-P檢測(cè)靈敏度分析

咖啡引物與探針的檢測(cè)靈敏度，指在35個(gè)循環(huán)內(nèi)對(duì)咖啡基因組DNA的檢測(cè)陽性的最低DNA量。從圖2A可知，本檢測(cè)體系對(duì)咖啡基因組DNA的檢測(cè)敏感度為0.1 ng/μL，即建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的定性最低檢測(cè)限為0.1 ng/μL。用初始等濃度的大豆DNA梯度稀釋咖啡DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度檢測(cè)，結(jié)果如圖2B所示，實(shí)驗(yàn)靈敏度達(dá)到0.1%（DNA濃度百分?jǐn)?shù)）。

3.3 穩(wěn)定性分析

圖1 咖啡引物探針XMT1-F/XMT1-R/XMT1-P實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)

圖2 咖啡DNA實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度檢測(cè)

選取濃度分別為 10.0 ng/μL、1.0 ng/μL、0.1 ng/μL的咖啡DNA作模板，25 μL體系內(nèi)加1 μL的DNA，每個(gè)濃度做20個(gè)平行，進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖3所示，本實(shí)驗(yàn)體系能穩(wěn)定檢測(cè)出咖啡DNA。

3.4 市售咖啡的應(yīng)用檢測(cè)

選取市售的咖啡進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)咖啡引物探針的實(shí)際應(yīng)用檢測(cè)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，本檢測(cè)體系的咖啡引物探針對(duì)來自世界各地的16種市售咖啡豆（C1～C16）均有明顯擴(kuò)增。然而對(duì)速溶咖啡（C17～C20）的擴(kuò)增曲線不明顯，在咖啡瓶裝飲料（C21～C24）中也未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。

圖3 咖啡DNA實(shí)時(shí)熒光PCR穩(wěn)定性檢測(cè)

圖4 市售咖啡豆和咖啡飲料的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

4 討論與分析

近年來，PCR及其衍生技術(shù)的快速發(fā)展大大推動(dòng)了物種鑒定技術(shù)的快速發(fā)展。Ferreira等設(shè)計(jì)了咖啡特異性引物對(duì)，用實(shí)時(shí)熒光PCR染料法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量檢測(cè)咖啡中的摻假谷物成分。而Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR探針法具有重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、線性范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，在各個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[13]。建立探針法定性檢測(cè)咖啡成分，對(duì)日后更加準(zhǔn)確地定量檢測(cè)咖啡摻假有重要的意義。另外，還可以為日后鑒別阿拉比卡與羅布斯塔兩個(gè)咖啡物種提供分子生物學(xué)技術(shù)支持。

咖啡的XMT1酶是咖啡物種中咖啡因生物合成途徑上的關(guān)鍵酶，也是咖啡特有的蛋白質(zhì)，阿拉比卡和羅布斯塔兩種咖啡都含有此酶的基因。本實(shí)驗(yàn)選取XMT1基因上的特異性片段設(shè)計(jì)了一套引物及探針，進(jìn)行咖啡成分的實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)，結(jié)果表明，這組引物探針可以特異性的擴(kuò)增咖啡，與常見豆類、谷物、蔬菜、水果以及動(dòng)物均無交叉反應(yīng)，具有咖啡物種特異性。在DNA百分比水平上，這組引物探針的檢測(cè)靈敏度為0.1%；在DNA質(zhì)量靈敏度的測(cè)試中，檢測(cè)靈敏度為0.1 ng/μL。

在提取咖啡DNA的方法研究上，Martellossi C等[14]和Spaniolas S等[15]使用了多種DNA提取方法來獲得各種咖啡豆、咖啡粉和速溶咖啡的DNA。參照先前文獻(xiàn)，對(duì)于市售咖啡的檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)使用了3種DNA提取試劑盒 （Kurabo、Promega和PSS）提取咖啡樣品的DNA。提取效果取決于樣品的狀態(tài)，在咖啡豆中可以提取出高質(zhì)量和數(shù)量的DNA。然而在速溶咖啡和咖啡飲料中未能得到合適數(shù)量和質(zhì)量的DNA，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性?？赡苡捎谒偃芸Х冗€有其他含咖啡產(chǎn)品的咖啡含量相對(duì)較少，加之制作工藝對(duì)咖啡DNA有破壞降解作用，造成DNA提取質(zhì)量和數(shù)量不理想，檢測(cè)結(jié)果不如預(yù)期?，F(xiàn)有的提取方法不一定適合咖啡衍生產(chǎn)品的DNA提取，因此，日后需要對(duì)工業(yè)加工的咖啡產(chǎn)品DNA提取方法作進(jìn)一步研究。

本研究建立的咖啡物種特異性實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)方法具有穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)，通過一系列的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，說明PCR定性檢測(cè)體系在分子水平鑒定咖啡是可行的。此方法能快速、準(zhǔn)確對(duì)咖啡進(jìn)行定性檢測(cè)，為今后利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)咖啡摻假提供技術(shù)依據(jù)。