蔣雪梅，權(quán) 毅

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科 四川瀘州 646000

乳腺癌是發(fā)生于乳腺腺上皮組織的一種惡性腫瘤，癌細(xì)胞極易脫落游離，導(dǎo)致遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[1]，而肺、骨、腦等全身重要器官的轉(zhuǎn)移均能直接威脅患者的生命，給乳腺癌的臨床治療增加了極大的困難[2]。近期研究[3-4]顯示，miRNA(miR)-27作為一種癌基因，在多種腫瘤中發(fā)揮致癌作用。miR-27在胃癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，能夠通過抑制ZBTB10蛋白的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[5]。上調(diào)miR-27表達(dá)能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲[6]。抑制miR-27的表達(dá)能夠通過調(diào)控Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路影響食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和侵襲[7]。目前研究[8]發(fā)現(xiàn)miR-27在乳腺癌組織中異常表達(dá)，且在浸潤性乳腺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，提示miR-27可能是乳腺癌進(jìn)展的重要標(biāo)志物。因此本實(shí)驗(yàn)通過在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-27 模擬物，探究上調(diào)miR-27對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為的影響及其作用的分子機(jī)制，以期為乳腺癌的治療提供新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑MCF-7細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；miR-27a-3p 模擬物及模擬物對(duì)照購自廣州銳博生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成；Trizol提取試劑盒購自日本TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qRT-PCR Master Mix購自大連寶生物工程有限公司；CCK-8試劑購自上海翊圣生物科技有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；Transwell小室購自美國Corning公司；ECL發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；PCNA、MMP-2、MMP-9抗體及二抗購自美國CST公司。

1.2細(xì)胞分組MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、95%濕度、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)更換新的培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長至約70%融合時(shí)，以2.5 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代。取第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至50%融合時(shí)按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別轉(zhuǎn)染miR-27a-3p 模擬物和模擬物對(duì)照，分別記為模擬物組和陰性對(duì)照組。未進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞記為空白對(duì)照組。3組MCF-7細(xì)胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3qRT-PCR法檢測3組細(xì)胞中miR-27a-3p的水平收集轉(zhuǎn)染48 h后的MCF-7細(xì)胞，以Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，檢測其濃度和純度后，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，操作步驟嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。獲取的cDNA調(diào)整濃度后采用SYBR Green qRT-PCR Master Mix進(jìn)行PCR反應(yīng)。miR-27a-3p上游引物5’-CACGCAATCTCTCT GGCG-3’，miR-27a-3p下游引物5’-CCAGTG CAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游引物5’-CTCGT TCGGCAGCACA-3’，U6下游引物5’-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3’。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算細(xì)胞中miR-27a-3p的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測3組細(xì)胞增殖能力將3組細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為1×105個(gè)/孔，培養(yǎng)24、48、72、96 h后分別在每孔中加入100 μL的CCK-8試劑，置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。以酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測細(xì)胞的吸光度值(A值)，以A值表示細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測3組細(xì)胞遷移和侵襲能力常規(guī)消化細(xì)胞，離心并收集，以無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成密度為2.5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取200 μL細(xì)胞懸液接種于Transwell小室的上室，在下室中加入800 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿透的細(xì)胞，以PBS洗滌3次，置于室溫下晾干約10 min，加入100 μL的吉姆薩染液進(jìn)行染色，于室溫下靜置20 min，然后以PBS洗滌3次，顯微鏡下觀察，每組選取10個(gè)視野(×100)，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，以表示細(xì)胞遷移能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

將Matrigel基質(zhì)膠于4 ℃冰箱中融化，然后于冰上將Matrigel膠與DMEM培養(yǎng)基以1∶4體積比混合，以20 μL/孔鋪于Transwell小室的上室，置于37 ℃培養(yǎng)箱中晾干，使用前30 min以無血清培養(yǎng)基清洗上室，吸取培養(yǎng)基后加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入800 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h。以PBS洗滌3次，除去PBS及懸浮的細(xì)胞，晾干，以甲醇固定10 min，結(jié)晶紫染色5 min，去離子水沖洗，晾干，倒置顯微鏡(×100)下計(jì)數(shù)細(xì)胞，以表示細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Westernblot檢測3組細(xì)胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，除去培養(yǎng)基，以 PBS洗滌3次，加入預(yù)冷的裂解液置于冰上充分裂解，4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，去上清，以BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白與上樣緩沖液按1∶4體積比混勻，在沸水中加熱10 min，使蛋白變性，以每孔30 μg變性蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳(100 g/L分離膠、50 g/L濃縮膠)，電泳條件：110 V恒壓電泳2 h。電泳結(jié)束后，4 ℃下250 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，在50 g/L的牛血清蛋白中于室溫下孵育2 h。PCNA(按1∶1 000稀釋)、MMP-2(按1∶800稀釋)、MMP-9(按1∶800稀釋)一抗雜交，4 ℃過夜孵育。二抗(按1∶2 000稀釋)雜交，室溫孵育2 h。ECL顯色，化學(xué)發(fā)光成像儀曝光，以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。3組間miR-27a-3p相對(duì)表達(dá)量，A值，侵襲細(xì)胞數(shù)，遷移細(xì)胞數(shù)，PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞中miR-27a-3p的表達(dá)水平qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、模擬物組MCF-7細(xì)胞中miR-27a-3p相對(duì)表達(dá)量分別為(1.00±0.01)、(1.01±0.01)、(2.76±0.31)(F=95.953，P<0.001)。與兩個(gè)對(duì)照組比較，模擬物組miR-27a-3p相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)。

2.2 3組細(xì)胞增殖能力的比較結(jié)果見表1。與其他2組比較， 模擬物組MCF-7細(xì)胞在24、48、72、96 h時(shí)增殖能力均增強(qiáng)。

表1 各組MCF-7細(xì)胞A值的比較(n=3)

*：與其他2組比較，P<0.05

2.3 3組細(xì)胞侵襲和遷移能力的比較結(jié)果見表2。與其他2組比較，模擬物組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)均增多。

表2 各組MCF-7細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)的比較(n=3)

*：與其他2組比較，P<0.05

2.4 3組細(xì)胞中PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的比較結(jié)果見圖1和表3。與其他2組比較，模擬物組MCF-7細(xì)胞PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平均升高。

1：空白對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：模擬物組

組別PCNAMMP-2MMP-9空白對(duì)照組0.14±0.020.57±0.040.61±0.05陰性對(duì)照組0.13±0.020.54±0.050.59±0.06模擬物組0.75±0.08?1.43±0.08?1.48±0.11?F157.625218.943127.698P<0.001<0.001<0.001

*：與其他2組比較，P<0.05

3 討論

乳腺癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移給臨床治療造成很大的困難，因此有效抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為成為治療乳腺癌的重要措施[9]。miR是一類廣泛存在的非編碼的小片段核糖核酸分子，具有調(diào)控生命活動(dòng)的功能。目前研究[10-12]顯示，miR在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中具有至關(guān)重要的作用。研究[13]發(fā)現(xiàn)，miR-27在腎癌中通過調(diào)控FOXO1的表達(dá)發(fā)揮致癌作用。胃癌患者外周血中miR-27含量異常升高，且miR-27能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[14]。miR-27a可影響甲狀腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲，提示miR-27a可能作為甲狀腺癌的生物標(biāo)志物[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-27a-3p模擬物能夠成功上調(diào)MCF-7細(xì)胞中miR-27a-3p的表達(dá)。上調(diào)miR-27a-3p表達(dá)后，MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均提高。

miR-27具有調(diào)控多種靶基因和信號(hào)通路的作用。Wang等[16]的實(shí)驗(yàn)表明，miR-27通過調(diào)控Wnt信號(hào)通路抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。利拉魯肽能夠抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖，且能促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與利拉魯肽下調(diào)miR-27a表達(dá)有關(guān)[17]。本實(shí)驗(yàn)中模擬物組MCF-7細(xì)胞中PCNA表達(dá)水平顯著升高，說明在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中miR-27a-3p通過上調(diào)PCNA的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖。MMP-2和MMP-9屬于MMP家族，其主要功能是維持重塑和降解細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，參與腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲過程[18-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模擬物組MCF-7細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平明顯升高，提示miR-27a-3p通過上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲和遷移。

綜上，上調(diào)miR-27a-3p能夠促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，其作用機(jī)制與促進(jìn)PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)。