來衛(wèi)東,戴尊收,趙愛國(guó),胡娜,劉琳琳,顧潤(rùn)國(guó)

(1山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，山東臨沂 276000；2山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院)

miRNA-30a-5p過表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0增殖、凋亡的影響

來衛(wèi)東1,戴尊收2,趙愛國(guó)1,胡娜1,劉琳琳1,顧潤(rùn)國(guó)1

(1山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，山東臨沂 276000；2山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院)

目的觀察miRNA-30a-5p過表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0增殖、凋亡的影響，并探討其機(jī)制。方法將腎癌細(xì)胞株786-0分為模擬物組、抑制物組、未轉(zhuǎn)染組，模擬物組轉(zhuǎn)染miRNA-30a-5p模擬物，抑制物組轉(zhuǎn)染miRNA-30a-5p抑制物，未轉(zhuǎn)染組為正常腎癌細(xì)胞株786-0。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)模擬物組、抑制物組、未轉(zhuǎn)染組腎癌細(xì)胞株786-0及正常人腎小管上皮細(xì)胞HK-2(正常組)miRNA-30a-5p，CCK-8法觀察各組培養(yǎng)24、48、72 h后的細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)觀察前三組細(xì)胞凋亡情況，Western blotting法檢測(cè)前三組細(xì)胞中異黏蛋白(MTDH)表達(dá)。結(jié)果正常組、模擬物組、抑制物組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miRNA-30a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.32±0.05、0.32±0.05、0.52±0.06，正常組、模擬物組、抑制物組與未轉(zhuǎn)染組相比，P均<0.01。正常組在培養(yǎng)24、48、72 h后的吸光度值分別為0.26±0.02、0.44±0．03、0.73±0.06，模擬物組分別為0.33±0.04、0.50±0.05、0.88±0.05，抑制物組分別為0.86±0．01、1.88±0.12、2.48±0.15，未轉(zhuǎn)染組分別為0.62±0.01、1.63±0.02、2.34±0.23，正常組、模擬物組各時(shí)點(diǎn)分別與抑制物組、未轉(zhuǎn)染組相比，P均<0.01。模擬物組、抑制物組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率分別為11.91%±0.45%、5.23%±0.38%、6.77%±0.52%，模擬物組與抑制物組、未轉(zhuǎn)染組相比，P均<0.01。模擬物組、抑制物組、未轉(zhuǎn)染組MTDH蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.14±0.08、6.31±0.24、5.56±0.06，模擬物組與抑制物組、未轉(zhuǎn)染組相比，P均<0.01。結(jié)論miRNA-30a-5p過表達(dá)可明顯抑制腎癌細(xì)胞株786-0的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其可能是通過調(diào)控MTDH蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

腎細(xì)胞癌；微小RNA-30a-5p；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；異黏蛋白

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤，在過去20年里其發(fā)病率呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。隨著對(duì)腎癌發(fā)生、發(fā)展過程中分子機(jī)制的深入研究，尋找調(diào)控腎癌細(xì)胞增殖分化的相關(guān)基因，已成為腎癌分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。微小RNA(miRNA)自1993年被首次發(fā)現(xiàn)以來，大量研究證實(shí)miRNA參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡。miRNA-30a系miRNA-30家族成員，編碼基因定位于人類染色體6ql3,與很多惡性腫瘤相關(guān)[1]。已有研究指出miRNA-30a-5p是調(diào)控肝癌、肺癌等腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素。目前，miRNA-30a-5p在腎癌細(xì)胞中的作用未見研究報(bào)道。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)研究顯示異黏蛋白(MTDH)是miRNA-30a-5p可能作用的靶基因[2]。2014年7月～2016年7月，我們觀察了miRNA-30a-5p過表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0增殖凋亡的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 腎癌細(xì)胞株786-0及正常人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000)轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miRNA-30a-5p模擬物、抑制物、特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物及PCR引物均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；CCK-8試劑盒(cell counting Kit-8)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒及SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自北京TIANGEN生化科技有限公司。兔抗MTDH多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 分別將腎癌細(xì)胞株786-0及人腎小管上皮細(xì)胞HK-2接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換培養(yǎng)液1次，視細(xì)胞生長(zhǎng)情況用0.25%的胰酶消化每周傳代1～2次，當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)開始用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將腎癌細(xì)胞株786-0分為模擬物組、抑制物組、未轉(zhuǎn)染組，模擬物組轉(zhuǎn)染miRNA-30a-5p模擬物，抑制物組轉(zhuǎn)染miRNA-30a-5p抑制物，未轉(zhuǎn)染組為正常腎癌細(xì)胞株786-0。轉(zhuǎn)染前24 h于6孔板中接種模擬物組、抑制物組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，細(xì)胞密度為2×105/mL。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染miRNA-30a-5p模擬物或抑制物。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后用轉(zhuǎn)染試劑于37 ℃在培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，每孔中加入含有20%胎牛血清無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至24 h，更換為新鮮含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 各組細(xì)胞miRNA-30a-5p mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。收集轉(zhuǎn)染48 h后模擬物組、抑制物組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，同時(shí)收集呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常人腎小管上皮細(xì)胞HK-2(正常組)，按照RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度與純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞miRNA-30a-5p mRNA的表達(dá)。每個(gè)樣本重復(fù)3次。反應(yīng)體系：SYBR Green Supermix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA樣品1 μL,dH2O 8 μL，共計(jì)20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)，95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析，95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增miRNA-30a-5p的同時(shí)，擴(kuò)增管家基因U6。miRNA-30a-5p特異性莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGFFTTGAGCTTCCAGT-3′；上游序列:5′-CACTCTCATGTAAACATCCTCGAC-3′，下游序列：5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3′；內(nèi)參U6引物，上游序列：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游序列：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。將正常組設(shè)為對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)化為1，采用2-ΔΔCt法分析各組miRNA-30a-5p mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 各組細(xì)胞增殖情況觀察 采用CCK-8法。制備上述4組單細(xì)胞懸液，將1×103～1×104/mL細(xì)胞接種于96孔板，每孔體積100 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，模擬物組、抑制物組轉(zhuǎn)染miRNA-30a-5p模擬物和抑制物。將轉(zhuǎn)染后6 h換液時(shí)間作為CCK-8實(shí)驗(yàn)的0 h，分別培養(yǎng)24、48、72 h后加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃繼續(xù)孵育4～6 h，終止培養(yǎng)，吸棄上清液。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)各孔吸光度值，記錄結(jié)果。

1.2.5 各組細(xì)胞凋亡情況觀察 將6孔板中轉(zhuǎn)染48 h后模擬物組、抑制物組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞用胰酶消化后，收集細(xì)胞懸液于室溫下離心5 min。棄上清液后收集細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。離心，收集細(xì)胞，用250 μL稀釋的混合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度不少于1×105/mL。取100 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL的Annexin V-FITC與1 μL的碘化丙錠染色，混勻后室溫下避光孵育15 min。加400 μL的1×PBS緩沖液于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

1.2.6 各組細(xì)胞MTDH蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集轉(zhuǎn)染48 h后模擬物組、抑制物組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)樣品蛋白含量。分別取樣品蛋白20 μg加上樣緩沖液至終體積15 μL，以10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。取出硝酸纖維素濾膜，置于5%脫脂奶粉(用PBS配制)室溫2 h封膜。加入MTDH一抗(1 μL一抗加入0.02 mmol/L PBST 2 mL)4 ℃孵育過夜，0.02 mmol/L PBST洗膜3次。加入二抗室溫孵育2 h，洗膜3次。DAB顯色。凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞miRNA-30a-5p mRNA表達(dá)比較 正常組、模擬物組、抑制物組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miRNA-30a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.32±0.05、0.32±0.05、0.52±0.06，正常組、模擬物組、抑制物組與未轉(zhuǎn)染組相比，P均<0.01。

2.2 各組細(xì)胞增殖活性比較 正常組在培養(yǎng)24、48、72 h后的吸光度值分別為0.26±0.02、0.44±0．03、0.73±0.06，模擬物組分別為0.33±0.04、0.50±0.05、0.88±0.05，抑制物組分別為0.86±0．01、1.88±0.12、2.48±0.15，未轉(zhuǎn)染組分別為0.62±0.01、1.63±0.02、2.34±0.23，正常組、模擬物組各時(shí)點(diǎn)分別與抑制物組、未轉(zhuǎn)染組相比，P均<0.01。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 模擬物組、抑制物組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率分別為11.91%±0.45%、5.23%±0.38%、6.77%±0.52%，模擬物組與抑制物組、未轉(zhuǎn)染組相比，P均<0.01。

2.4 各組細(xì)胞MTDH蛋白表達(dá)比較 模擬物組、抑制物組、未轉(zhuǎn)染組MTDH蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.14±0.08、6.31±0.24、5.56±0.06，模擬物組與抑制物組、未轉(zhuǎn)染組相比，P均<0.01。

3 討論

腎癌占成人惡性腫瘤的2%～7%，早期腎癌主要采取手術(shù)治療，但手術(shù)方式的進(jìn)步并未顯著提高腎癌患者的生存率。由于腎癌細(xì)胞的生物學(xué)行為復(fù)雜多變，且具有放化療抵抗特點(diǎn)，近30%的手術(shù)患者術(shù)后3年內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)，總體5年生存率不到10%[3]。因此，研究調(diào)控腎癌細(xì)胞增殖分化的相關(guān)基因，通過靶向抑制，對(duì)提高腎癌患者的生存率，具有重要意義。

miRNA作為新興的生物標(biāo)志物，有望成為腎癌診斷治療及判斷預(yù)后的重要靶點(diǎn)。miRNA在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中，既可以表達(dá)上調(diào)發(fā)揮致癌基因的作用，也可以表達(dá)下調(diào)發(fā)揮抑癌基因的作用[4]。并且，腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性亦受miRNA的影響[5]。目前，miRNA在腎腫瘤中的研究還處在初級(jí)階段。Chow等[6]發(fā)現(xiàn)，33種miRNA在腎透明細(xì)胞癌組織中發(fā)生改變，其中21種呈高表達(dá)的miRNA在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展中起非常重要的作用。腎細(xì)胞癌體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)顯示，miRNA-137通過抑制磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B信通路抑制腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)[7]。此外，多項(xiàng)研究[8～10]顯示miRNA-141-3p、miRNA-145-5p、miRNA-218及miRNA-27a等均在腎癌中起抑癌基因作用。但另有研究[11]發(fā)現(xiàn)miR-630在腎癌細(xì)胞中扮演著促癌基因的角色。

miRNA-30家族的成員包括miRNA-30a、miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-30d、miRNA-30e等，miRNA-30a產(chǎn)生于內(nèi)含子翻譯單位，有miRNA-30a-3p、miRNA-30a-5p兩種形式[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)miRNA-30a/miRNA-30a-5p可在卵巢癌、乳腺癌、肝癌、白血病等多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[12～15]，然而miRNA-30a-5p在腎癌細(xì)胞中的作用未見研究報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未轉(zhuǎn)染組較正常組miRNA-30a-5p表達(dá)下調(diào)，且與抑制物組、未轉(zhuǎn)染組比較，模擬物組細(xì)胞增殖能力明顯下降，細(xì)胞凋亡明顯增加。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miRNA-30a-5p的高表達(dá)可抑制腎癌786-0細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，miRNA-30a-5p在腎癌的發(fā)展中起抑癌基因的作用。

MTDH在多種腫瘤(如肝癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等[16～18])中呈高表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲性，并介導(dǎo)多種形式的化療抵抗。Li等[2]通過熒光素酶活性分析實(shí)驗(yàn)證實(shí)MTDH是miRNA-30a-5p的直接靶向基因，在肝癌組織中，miRNA-30a-5p的表達(dá)與MTDH的表達(dá)具有明顯的負(fù)相關(guān)。亦有實(shí)驗(yàn)表明，miRNA-30a可通過MTDH實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌腫瘤細(xì)胞的抑制作用[19]。秦丹丹等[20]研究認(rèn)為，MTDH與miRNA-30a結(jié)合位點(diǎn)具有物種保守性。在腎癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-30a類似物后，MTDH表達(dá)被抑制，MTDH與miRNA-30a具有靶向關(guān)系。此外，通過上調(diào)miR-30d的表達(dá)可靶向Akt/FOXO抑制MTDH的表達(dá)，從而抑制腎癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模擬物組MTDH蛋白的相對(duì)表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染組及抑制組明顯下降，提示miRNA-30a-5p可能通過靶向MTDH而抑制腎癌細(xì)胞株786-0的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miRNA-30a-5p在腎癌細(xì)胞中起抑癌基因的作用，其可能是通過調(diào)控MTDH蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。但是，同一miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，不同的miRNA分子也可協(xié)同調(diào)控同一靶基因。miRNA與它們的靶基因組成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)。因此，還應(yīng)該進(jìn)一步研究腎癌細(xì)胞中異常表達(dá)的miRNA之間的相互聯(lián)系，為腎癌的早期診斷治療提供新的分子生物學(xué)靶點(diǎn)。

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EffectsofoverexpressionofmiRNA-30a-5ponproliferationandapoptosisofrenalcarcinomacellline786-0

LAIWeidong1,DAIZunshou,ZHAOAiguo,HUNa,LIULinlin,GURunguo

(1ShandongMedicalCollege,Linyi276000,China)

ObjectiveTo observe the influence of overexpression of miRNA-30a-5p on the proliferation and apoptosis of renal carcinoma cell line 786-0, and to explore the mechanism.MethodsThe renal carcinoma 786-0 cells were divided into the mimic group, the inhibitor group, and the non-transfected group. The cells in the mimic group were transfected with miRNA-30a-5p mimics, cells in the inhibitor group were transfected with miRNA-30a-5p inhibitor, and in the non-transfected group, the cells were normal renal carcinoma 786-0 cells. The expression of miRNA-30a-5p mRNA in the mimics group, inhibitor group, non-transfected group, and normal human renal tubular epithelial cells HK-2 (normal group) were detected by real-time fluorescence quantitative PCR; the cell proliferation at 24, 48, and 72 h after transfection was evaluated by using CCK-8 assay; the apoptosis of the former three groups was assessed by flow cytometry; the expression of MTDH protein in the former three groups was detected by Western blotting.ResultsThe miRNA-30a-5p mRNA expression in the normal group, mimic group, inhibitor group, and non-transfected group was 1.00±0.00, 1.32±0.05, 0.32±0.05, and 0.52±0.06, respectively; significant difference was found between the normal group, mimic group, inhibitor group, and the non-transfected group (allP<0.01). The absorbance values of the normal group at 24, 48, and 72 h were 0.26±0.02, 0.44±0.03, and 0.73±0.06, respectively; the absorbance values of the mimic group were 0.33±0.04, 0.50±0.05, and 0.88±0.05, respectively; in the inhibitor group they were 0.86±0.01, 1.88±0.12, and 2.48±0.15, respectively; in the non-transfected group, they were 0.62±0.01, 1.63±0.02, and 2.34±0.23, respectively; significant difference was found between the normal group, the mimic group, and the inhibitor group and the non-transfected group at each time point, allP<0.01. The apoptosis rates in the mimic group, inhibitor group, and non-transfected group were separately 11.91%±0.45%, 5.23%±0.38%, and 6.77%±0.52%; significant difference was found between the mimic group and between the inhibitor group and non-transfected group, allP<0.01. The expression levels of MTDH protein in the mimic group, inhibitor group, and non-transfected group were separately 1.14±0.08, 6.31±0.24, and 5.56±0.06, and significant difference was found in the expression of MTDH protein of the mimic group as compared with that of the inhibitor group and non-transfected group, allP<0.01.ConclusionOverexpression of miRNA-30a-5p may inhibit 786-0 cell proliferation and promote the apoptosis by regulating the expression of MTDH.

renal cell carcinoma; micro RNA-30a-5p; cell proliferation ; apoptosis; metadherin

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.007

R737.11

A

1002-266X(2017)38-0023-04

山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目(J13LL08);山東省臨沂市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(201515055)。

來衛(wèi)東(1978-)，男，副教授，主要研究方向?yàn)槊谀蛳的[瘤的分子機(jī)制。E-mail: lwddoctor@126.com

顧潤(rùn)國(guó)(1966-)，男，教授，主要研究方向?yàn)槊谀蛳的[瘤的分子機(jī)制。E-mail: geda576@163.com

2017-04-10)