孫梓程，陳海軍，劉 巖，范德標(biāo)，尹中波，關(guān)紅偉(南通市第六人民醫(yī)院普外科，南通 60；南通市第六人民醫(yī)院病理科；南通市第六人民醫(yī)院信息科)

大腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率逐年遞增，嚴(yán)重威脅著國(guó)民健康安全[1]。大腸癌起病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已步入晚期。流行病學(xué)研究證實(shí)[2]，大腸癌病發(fā)隱匿特征使得約30%患者確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，探討大腸癌病發(fā)及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制并為靶向治療提供新思路至關(guān)重要。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞在特定病理和生理情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，EMT已被證實(shí)與多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移遷移密切相關(guān)。特異性泛素肽酶22(ubiquitin-specific peptidase 22，USP22)是一種新型的去泛素化水解酶[3]。研究證實(shí)[4]，USP22信號(hào)通路的表達(dá)可促使大腸癌細(xì)胞獲得干細(xì)胞樣表型，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，但其具體調(diào)控分子機(jī)制仍尚未明確。miRNAs是大約有22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的非編碼RNA，已被證實(shí)在諸多癌癥的惡性分化、增殖、遷移過(guò)程中扮演重要角色[5]。miR-365是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，已被證實(shí)在胃癌、肺癌和肝癌等惡性腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮生物學(xué)功能[6]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，miR-365與USP22的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。但miR-365能否通過(guò)靶向調(diào)控USP22的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)影響組蛋白泛素化修飾并促進(jìn)EMT過(guò)程，最終使大腸癌發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移仍缺乏系統(tǒng)報(bào)道?；诖吮尘?，本研究擬從miR-365對(duì)USP22的靶向調(diào)控機(jī)制角度探討大腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為靶基因的篩選奠定基礎(chǔ)，為臨床上實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸癌轉(zhuǎn)移的有效干預(yù)提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

大腸癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HCT-116、LoVo和中低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SW480細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。miR-365模擬物和miR-365抑制物購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司；Transfection Kit和miRNA NC購(gòu)自上海美軒生物科技有限公司。miRNA Isolation Kit購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；miRNA檢測(cè)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄引物購(gòu)自青旗(上海)生物技術(shù)發(fā)展有限公司；DEME培養(yǎng)基、RPMI1640和胎牛血清購(gòu)自北京華研世佳質(zhì)檢科技有限公司?？菇M蛋白H2B抗體、泛素化組蛋白H2A抗體(Lys119)、抗組蛋白H2A抗體、泛素化組蛋白H2B抗體(Lys120)均購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(高糖)培養(yǎng)HCT-116、LoVo和SW480細(xì)胞。HCT-116、LoVo和SW480細(xì)胞，在5%CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期傳代。將SW480細(xì)胞接種到6孔板并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行miR-365抑制物、模擬物和miR-NC的轉(zhuǎn)染操作，分別分為miR-365抑制物組、miR-365模擬物組和NC組，連續(xù)轉(zhuǎn)染48 h。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。

1.3 采用RT-PCR檢測(cè)miR-365和USP22 mRNA水平

采用Trizol提取大腸癌細(xì)胞中總RNA，并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行后續(xù)操作。PCR反應(yīng)條件為：70 ℃ 35 s、58 ℃ 35 s、95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 min，共35個(gè)循環(huán)，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)4次，最后取平均值。引物序列見(jiàn)表1。以GAPDH管家基因作為對(duì)照檢測(cè)USP22mRNA，以U6作為miR-365的內(nèi)部對(duì)照。USP22和miR-365 mRNA的表達(dá)采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-PCR

1.4 采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-365與USP22的相互作用

將SW480細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞匯合度達(dá)60%后嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分組如下：miR-365+USP22-mut組、miR-NC+USP22-mut組、miR-365+USP22-wt組和miR-NC+USP22-wt組。48 h后收集細(xì)胞并檢測(cè)熒光素酶活性，檢測(cè)采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒。

1.5 采用Western blot法檢測(cè)USP22信號(hào)通路下游EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

采用Western blot法檢測(cè)miR-365抑制物組、miR-365模擬物組和NC組SW480細(xì)胞中Vimentin、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)情況，具體方法為：收集大腸癌SW480細(xì)胞后，采用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中總蛋白約30 μg，隨后進(jìn)行凝膠電泳分離和轉(zhuǎn)移，并在5%脫脂牛奶中封閉1 h，并在4 ℃條件下過(guò)夜孵育。次日進(jìn)行二抗孵育，在室溫下進(jìn)行緩沖液清洗。孵育1 h后再次沖洗，進(jìn)行顯影液曝光顯影，試劑采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑。蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行4次，最后計(jì)算平均值。

1.6 采用斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)H2A和H2B蛋白泛素化修飾

采用斑點(diǎn)雜交法[7]檢測(cè)miR-365抑制物組、miR-365模擬物組和NC組SW480細(xì)胞中H2BKl20ub(組蛋白H2B作為內(nèi)參)和H2AK119ub(組蛋白H2A作為內(nèi)參)水平，即取50 μl SW480細(xì)胞加到硝酸纖維素膜上，經(jīng)麗春紅S染膜液出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)證實(shí)蛋白結(jié)合到硝酸纖維素膜上。避光洗膜后，使用Odyssey近紅外成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)，并對(duì)每個(gè)斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，最終結(jié)果由目的蛋白/內(nèi)參蛋白獲得。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力

收集miR-365抑制物組、miR-365模擬物組和NC組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，將細(xì)胞放置于5%CO2孵箱37 ℃培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合率達(dá)到90%左右時(shí)，在垂直方向，用1 ml微量移液器槍頭在6孔板底部做橫線劃痕，劃下的細(xì)胞經(jīng)PBS沖洗去除，之后細(xì)胞繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)后24 h，于倒置光學(xué)顯微鏡下拍照觀察，并計(jì)算劃痕愈合率：劃痕愈合率=(劃痕后即刻的劃痕面積-劃痕后48 h的劃痕面積)/劃痕后即刻的劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

Transwell實(shí)驗(yàn)分為miR-365抑制物組、miR-365模擬物組和NC組。將細(xì)胞濃度調(diào)整至2.0×105個(gè)/ml，調(diào)整方案采用無(wú)血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液；隨后在Transwell小室下層加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μl，并將調(diào)整好的細(xì)胞接種至Transwell小室上層，培養(yǎng)48 h。隨后采用95%乙醇固定30 min，染色后讀取細(xì)胞數(shù)。最后細(xì)胞數(shù)確定方案：隨機(jī)選取5個(gè)視野，取視野中平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同大腸癌細(xì)胞株中miR-365 mRNA的表達(dá)

HCT-116和LoVo細(xì)胞系中miR-365 mRNA表達(dá)量顯著低于SW480細(xì)胞系(P<0.05，見(jiàn)圖1)。轉(zhuǎn)染后，與NC組比較，miR-365抑制物組miR-365 mRNA的表達(dá)顯著降低，而miR-365模擬物組則升高(P<0.05，見(jiàn)圖2)。

與HCT-116和LoVo細(xì)胞系相比較，*P<0.05圖1 RT-PCR法檢測(cè)不同大腸癌細(xì)胞株中miR-365 mRNA的表達(dá)Figure 1 Expression of miR-365 mRNA in different colorectal cancer cell lines by RT-PCR

與NC組相比較，*P<0.05圖2 RT-PCR法檢測(cè)miR-365在轉(zhuǎn)染后大腸癌細(xì)胞系SW480的表達(dá)Figure 2 Expression of miR-365 in colorectal cancer cell line SW480 after different transfection by RT-PCR

2.2 miR-365和USP22的靶向關(guān)系

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后miR-NC+USP22-wt熒光素酶活性明顯高于miR-365+USP22-wt(P<0.05)，而miR-365+USP22-mut組和miR-NC+USP22-mut組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖3)。

與miR-365+USP22-wt相比較，*P<0.05圖3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-365和USP22的靶向關(guān)系Figure 3 Targeting relationship between miR-365 and USP22 verified by double luciferase reporter gene

2.3 miR-365對(duì)SW480細(xì)胞中USP22 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組比較，miR-365抑制物組SW480細(xì)胞中USP22 mRNA的表達(dá)量顯著升高，而miR-365模擬物組則降低(P<0.05，見(jiàn)圖4)。

與NC組相比較，*P<0.05圖4 RT-PCR法檢測(cè)miR-365對(duì)SW480細(xì)胞中USP22 mRNA表達(dá)的影響Figure 4 Effect of miR-365 on the expression of USP22 mRNA in SW480 cells detected by RT-PCR

2.4 miR-365對(duì)H2A和H2B蛋白泛素化修飾水平的影響

與NC組比較，miR-365抑制物組H2AK119ub表達(dá)量顯著升高，而miR-365模擬物組則降低(P<0.05，見(jiàn)圖5)；與NC組比較，miR-365抑制物組H2BK120ub表達(dá)量顯著升高，而miR-365模擬物組則降低(P<0.05，見(jiàn)圖5)。

與NC組相比較，*P<0.05圖5 斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)H2A和H2B蛋白泛素化修飾水平Figure 5 H2A and H2B protein modification level detected by dot blot hybridization

2.5 miR-365對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與NC組比較，miR-365抑制物組SW480細(xì)胞中N-cadherin蛋白表達(dá)量顯著降低，而miR-365模擬物組則升高(P<0.05)；與NC組比較，miR-365抑制物組SW480細(xì)胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著升高，而miR-365模擬物組則降低(P<0.05，見(jiàn)圖6)。

與NC組相比較，*P<0.05圖6 Western blot法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平Figure 6 EMT-related protein expression in SW480 cells after different transfection detected by Western blot

2.6 miR-365對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

與NC組比較，miR-365抑制物組愈合率明顯升高(P<0.05)，而miR-365模擬物組明顯降低(P<0.05，見(jiàn)圖7)，提示SW480細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力被明顯增強(qiáng)。

與NC組相比較，*P<0.05圖7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力Figure 7 Cell metastasis of SW480 cells after different transfection by cell scratch test

2.7 Transwell檢測(cè)miR-365對(duì)SW480細(xì)胞遷移的影響

與NC組比較，視野下miR-365抑制物組SW480細(xì)胞穿模數(shù)量明顯升高，miR-365模擬物組明顯降低(P<0.05，見(jiàn)圖8，9)，表明miR-365的表達(dá)降低有利于SW480細(xì)胞的遷移。

圖8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-365對(duì)SW480細(xì)胞遷移能力的影響Figure 8 Cell migration of SW480 cells after different transfection by Transwell test

與NC組相比較，*P<0.05圖9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞穿模數(shù)量Figure 9 The number of SW480 cells penetrating the mold after different transfection by Transwell test

3 討論

近來(lái)隨著輔助治療手段的更新、靶向分子藥物的研發(fā)和外科技術(shù)的進(jìn)步大腸癌的死亡率得到改善，但仍處于較高水平。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是大腸癌患者死亡的重要因素[8]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要病理過(guò)程，上皮細(xì)胞發(fā)生EMT使細(xì)胞間連接解體，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變使間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上升，而上皮標(biāo)志物表達(dá)逐漸降低，引起細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)及基底膜降解，使得腫瘤細(xì)胞失去細(xì)胞間的上皮極性和黏附作用，從而獲得侵襲和遷移的能力[9-11]。大腸癌作為起源于上皮的惡性腫瘤，研究證實(shí)，其遷移前沿的病理組織中存在EMT樣的腫瘤細(xì)胞[12]。USP22是最新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)基因，與腫瘤的增殖、遷移等過(guò)程密切相關(guān)[13]。Zhang等[14]證實(shí)，USP22的表達(dá)上調(diào)與EMT相關(guān)蛋白表達(dá)被激活十分相關(guān)。鮑潔等[15]證實(shí)，miR-101可靶向調(diào)控USP22水平影響肝癌MHCC97H細(xì)胞的EMT病理過(guò)程，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。Liu等[16]發(fā)現(xiàn)，USP22的異常表達(dá)與結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而大腸癌患者USP22表達(dá)的調(diào)控機(jī)制仍尚未明確。miRNA作為小的非編碼RNA，是大腸癌轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子[17]。Hong等[18]證實(shí)，結(jié)直腸癌患者中miR-31-5可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)NUMB抑制HT29細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Jian等[19]發(fā)現(xiàn)，大腸癌患者循環(huán)miR-15b的高豐度與腫瘤轉(zhuǎn)移十分相關(guān)。miR-365是miRNA家族一員，被證實(shí)與肝癌、非小細(xì)胞肺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等疾病的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)，但在大腸癌中仍未見(jiàn)報(bào)道，尤其USP22信號(hào)通路是否為miR-365的靶基因亦未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌高轉(zhuǎn)移細(xì)細(xì)胞株miR-365 mRNA的表達(dá)明顯低于中低轉(zhuǎn)移的細(xì)胞株。選取中低轉(zhuǎn)移的SW480的細(xì)胞進(jìn)行miR-365過(guò)表達(dá)和敲低模型構(gòu)建，并采用Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與miRNA-NC組比較，miR-365抑制物組SW480的細(xì)胞侵襲能力顯著升高，模擬物組明顯降低，同時(shí)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與NC組比較，miR-365抑制物組愈合率明顯升高，miR-365模擬物組顯著降低，表明在大腸癌的基礎(chǔ)病理發(fā)展中，miR-365扮演著抑癌基因的作用，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論基本一致[20，21]。本課題前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)USP22的3’UTR區(qū)有miR-365的特異性調(diào)控位點(diǎn)，且大腸癌組織中miR-365的表達(dá)與USP22的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。為深入明確miR-365的作用機(jī)制，本次課題采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-NC+USP22-wt熒光素酶活性明顯高于miR-365+USP22-wt，而miR-365+USP22-mut組和miR-NC+USP22-mut組比較無(wú)顯著差異，提示大腸癌細(xì)胞中miR-365和USP22基因的表達(dá)存在靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。同時(shí)本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，USP22與組蛋白的泛素化修飾存在相關(guān)性，推測(cè)USP22的表達(dá)改變后可通過(guò)調(diào)控組蛋白的泛素化修飾，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲過(guò)程發(fā)生。為驗(yàn)證上述科學(xué)假說(shuō)和深入分析miR-365調(diào)控大腸癌細(xì)胞遷移的機(jī)制，本次課題采用斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)H2B和H2A的泛素化修飾水平，結(jié)果顯示與NC組比較，miR-365抑制物組H2AK119ub表達(dá)量顯著升高，而miR-365模擬物組則降低(P<0.05)；與NC組比較，miR-365抑制物組H2BK120ub表達(dá)量顯著升高，而miR-365模擬物組則降低(P<0.05)；同時(shí)與NC組比較，miR-365抑制物組SW480細(xì)胞中N-cadherin蛋白表達(dá)量顯著降低，而miR-365模擬物組則升高(P<0.05)；與NC組比較，miR-365抑制物組SW480細(xì)胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著升高，而miR-365模擬物組則降低(P<0.05)，證實(shí)miR-365在大腸癌病理發(fā)展過(guò)程中扮演抑癌基因角色。

綜上所述，miR-365在大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，為后續(xù)研究大腸癌的發(fā)病機(jī)制及分析靶向藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。然而本次實(shí)驗(yàn)仍存在不足，如本次課題僅從細(xì)胞水平開(kāi)展了立體實(shí)驗(yàn)，故今后仍需進(jìn)一步從動(dòng)物水平設(shè)置在體實(shí)驗(yàn)予以論證。