鮑 曉 ，何成松)

1)西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院風濕免疫科 四川瀘州 646000 2)德陽市人民醫(yī)院風濕免疫科 四川德陽 618000

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一個多種基因、多種細胞因子和多種蛋白酶類共同參與的復雜過程，屬于自身免疫性疾病，以滑膜增生、慢性炎癥和骨與軟骨破壞為主要特征。Toll樣受體4(TLR4)是最早發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體家族成員，可通過脂多糖激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路,介導炎癥反應、細胞增殖、侵襲和凋亡等過程，與免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[1-3]。越來越多的研究[4-6]顯示，滑膜成纖維細胞的異常增殖和侵襲是RA發(fā)生發(fā)展的重要機制，抑制其惡性增殖和侵襲是改善和控制RA進展的重要手段。已有研究[7]報道，TLR4在RA患者外周血和滑膜組織中異常高表達，并調(diào)控NF-κB途徑介導的炎癥反應。本研究通過RNA干擾沉默人RA滑膜成纖維細胞MH7A中TLR4的表達，觀察TLR4沉默對MH7A細胞增殖和侵襲的影響，并探討其可能的分子機制，以期為深入研究TLR4在RA發(fā)生發(fā)展中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1細胞、試劑與儀器MH7A細胞株購于日本Tsukuba公司。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Hyclone公司，胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗和PBS溶液購于美國Gibco公司，脫脂奶粉購于武漢博士德公司。TLR4抗體購于英國Abcam公司，PCNA、MMP-9和VEGF抗體購于美國Santa Cruz 公司，β-actin抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗購于北京博奧森生物公司。脂質(zhì)體2000、MTT試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購于美國Invitrogen公司?？俁NA提取試劑盒購于日本TaKaRa公司。ECL液和BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天生物公司，總蛋白提取試劑盒購于上海索萊寶公司。PVDF膜購于美國Pirce公司。Transwell小室為美國Costar公司產(chǎn)品，多功能酶標儀和細胞培養(yǎng)箱為美國Thormo公司產(chǎn)品，PCR儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2實驗分組采用含體積分數(shù)10%胎牛血清和100 U/mL青鏈霉素雙抗的DEME培養(yǎng)基于體積分數(shù)5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)MH7A細胞。每2～3 d換新鮮培養(yǎng)液，待細胞鋪滿瓶底85%時，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，收集生長良好的第3代至5代細胞進行實驗。將對數(shù)生長期的MH7A細胞以胰蛋白酶消化，制成2.5×105個/mL的細胞懸液后，以每孔100 μL接種至6孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h至匯合度達70%左右時，分3組處理。NC-siRNA組和TLR4-siRNA組參照脂質(zhì)體2000的使用說明書操作，分別轉(zhuǎn)染陰性對照(NC)siRNA和TLR4-siRNA。NC-siRNA正義序列：5’-UUCUC CGAACGUGUCACGUTT-3’，反義序列：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；TLR4-siRNA正義序列：5’-CCACCUCUCUACCUUAAUATT-3’，反義序列：5’-UAUUAAGGUAGAGAGGUGGTT-3’；均由上海吉瑪公司合成?？瞻讓φ战M細胞不轉(zhuǎn)染，只加入含等量脂質(zhì)體2000的培養(yǎng)液培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 3組細胞中TLR4mRNA和蛋白的檢測①TLR4 mRNA的檢測：參照RNA提取試劑盒說明書步驟抽提細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄得cDNA。PCR反應體系包含SYBR?Premix Ex Taq(2×)10 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O7.2 μL。PCR擴增條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。采集數(shù)據(jù)，以β-actin作為看家基因，用2-ΔΔCt法計算TLR4 mRNA的相對表達量。TLR4引物F: 5’-TGAG GACCGACACACCAATG-3’，R: 5’-TGCAATGGAT CAAGGACCAG-3’；β-actin引物F: 5’-GCGCGGC TACAGCTTCA-3’，R: 5’-TCTCCTTAATGTCACG CACGAT-3’。引物均由美國Invitrogen公司合成。②TLR4蛋白的檢測：采用Western blot法。參照總蛋白提取試劑盒說明書提取細胞總蛋白，BCA法定量后，行SDS-PAGE凝膠電泳分離。電轉(zhuǎn)至PVDF膜后，于50 g/L去脂奶粉-TBST封閉液中室溫封閉1 h。加入稀釋度為1∶1 000的TLR4和內(nèi)參β-actin抗體4 ℃結合24 h，再加入稀釋度為1∶2 000的辣根過氧化酶標記的二抗室溫結合1 h。封閉液洗膜10 min×3次，ECL避光顯影曝光。凝膠成像系統(tǒng)采集圖片，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.4 3組細胞增殖活性的檢測調(diào)整對數(shù)生長期MH7A細胞的密度為3.5×104個/mL，按照每孔100 μL接種至96孔板上，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至70%匯合度時按照1.2的方法分3組處理，每組5個復孔。分別于轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，加入MTT試劑20 μL于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，加入二甲基亞砜，上多功能酶標儀檢測，檢測波長450 nm。以吸光度表示增殖活性，實驗重復3次。

1.5 3組細胞克隆形成能力的檢測轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集3組細胞接種于6孔板，每孔4×103個，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)14 d。棄培養(yǎng)液，磷酸緩沖液洗滌，多聚甲醛固定15 min，結晶紫染色30 min。洗去染液，顯微鏡下選取6個視野，計數(shù)細胞數(shù)大于20的克隆數(shù)，取均值表示克隆計數(shù)結果。實驗重復3次。

1.6 3組細胞侵襲能力的檢測轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集3組細胞，胰蛋白酶消化后以去血清培養(yǎng)基制備5×104個/mL的細胞懸液。取100 μL接種于Matrigel包被的Transwell小室上室，下室中加入含血清的完全培養(yǎng)基600 μL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)48 h，多聚甲醛固定，結晶紫染色。小心擦去小室上層未穿過濾膜的細胞，顯微鏡下選取6個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)，取均值表示最終計數(shù)結果。實驗重復3次。

1.7 3組細胞中PCNA、MMP-9、VEGF表達的檢測采用Western blot法，具體操作同1.3，其中PCNA、MMP-9、VEGF和β-actin抗體稀釋度均為1∶1 000。實驗重復3次。

1.8統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學分析。3組增殖活性、克隆計數(shù)、穿膜細胞數(shù)、各蛋白表達水平和TLR4 mRNA表達水平的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組細胞中TLR4的表達轉(zhuǎn)染48 h后，3組細胞中TLR4蛋白(圖1)和mRNA的表達情況見表1。TLR4-siRNA組細胞中TLR4蛋白和mRNA的表達均低于空白對照組和NC-siRNA組(P<0.05)。

圖1 Western blot法檢測TLR4 蛋白的表達

組別nTLR4蛋白 TLR4 mRNA空白對照組30.47±0.051.00±0.05NC-siRNA組30.52±0.040.94±0.07TLR4-siRNA組30.14±0.02?0.26±0.03?F85.267262.138P<0.001<0.001

*：與空白對照組和NC-siRNA組相比，P<0.05

2.2 3組細胞增殖活性、克隆形成能力和侵襲能力的比較結果見表2。與空白對照組相比，NC-siRNA組增殖活性、克隆形成能力和細胞侵襲能力無明顯變化，而TLR4-siRNA組細胞增殖活性、克隆形成能力和細胞侵襲能力均降低(P<0.05)。

表2 3組細胞增殖活性、克隆計數(shù)和穿膜細胞數(shù)的比較

*：與空白對照組和NC-siRNA組相比，P<0.05

2.3 3組細胞中PCNA、MMP-9和VEGF蛋白的表達見圖2和表3。與空白對照組相比，NC-siRNA組PCNA、MMP-9和VEGF蛋白表達無明顯變化，而TLR4-siRNA組3種蛋白的表達均降低(P<0.05)。

圖2 Westernblot法檢測 PCNA、 MMP-9和VEGF蛋白的表達

組別nPCNA MMP-9VEGF空白對照組30.52±0.030.83±0.060.74±0.05NC-siRNA組30.55±0.040.88±0.050.69±0.05TLR4-siRNA組30.26±0.02?0.41±0.03?0.13±0.03?F78.931123.47148.254P<0.001<0.001<0.001

*：與空白對照組和NC-siRNA組相比，P<0.05

3 討論

TLR4是一種膜結合蛋白，可通過識別并結合病原相關分子的模式與HMGB1結合，激活下游PI3K/AKT、NF-κB和JNK等信號通路，引起免疫炎癥、細胞增殖、侵襲和凋亡等一系列反應，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關[1-3]。TLR4/MyD88異常高表達能夠促進子宮內(nèi)膜異位癥異位細胞的增殖與侵襲[8]；LPS可誘導TLR4信號轉(zhuǎn)導途徑激活，促進食管鱗癌細胞增殖，增加促炎或免疫抑制性細胞因子TNF-α、TGF-β的生成并抑制抗炎細胞因子IL-10的產(chǎn)生[9]；而TLR4表達被阻斷后，HMGB1誘導的肝星狀細胞增殖能力明顯受到抑制[10]。RA是一種以滑膜組織炎性增生和浸潤為主要病理改變的自身免疫性疾病，而與炎癥關系密切的TLR4在RA中發(fā)揮著重要作用。miR-146a可通過抑制TLR4/NF-κB途徑抑制RA-FLSs的增殖和炎癥反應[11]；艾灸干預改善RA大鼠膝關節(jié)滑膜組織的病理改變與抑制TLR4/MyD88/NF-κB途徑異常激活，緩解炎癥性滑膜浸潤、滑膜細胞增殖等有關[12]；在南蛇藤素抗RA滑膜細胞侵襲的研究中，TLR4/NF-κB通路活化受阻下調(diào)MMP-9轉(zhuǎn)錄是重要的調(diào)控機制[13]。

我們通過脂質(zhì)體法將TLR4-siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染至人RA滑膜成纖維細胞MH7A，成功下調(diào)了細胞內(nèi)TLR4的表達，同時細胞的增殖活性、克隆形成能力和侵襲能力均受到抑制。結果提示，TLR4在RA滑膜成纖維細胞增殖和侵襲過程中發(fā)揮著重要的促進作用。PCNA是與細胞增殖關系密切的核抗原，是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，是一個反映細胞增殖狀態(tài)的指標[14]。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中研究較多的成員，其可通過調(diào)節(jié)降解和重塑作用維持細胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡，參與細胞的侵襲和遷移等過程，還可作為炎癥介質(zhì)參與細胞的炎癥反應，與RA炎性細胞浸潤關系密切[15]。VEGF是誘導滑膜血管生成的重要因子，可通過調(diào)控血管通透性促進細胞轉(zhuǎn)移和物質(zhì)滲透，在細胞遷移和黏附等過程中發(fā)揮重要作用[16]。已有研究[17-19]證實，TLR4的激活可上調(diào)淋巴瘤細胞中PCNA的表達，促進癌細胞的增殖；脂多糖以TLR4依賴的方式誘導人動脈平滑肌細胞MMP-9的表達；TLR4也可通過AKT通路誘導鼻息肉組織中VEGF的表達。本研究結果顯示，在TLR4低表達的MH7A細胞中3種蛋白的表達水平均明顯降低，提示沉默TLR4可通過下調(diào)PCNA、MMP-9和VEGF的表達抑制RA滑膜成纖維細胞的增殖和侵襲。

綜上所述，TLR4在RA發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，沉默TLR4可能通過下調(diào)PCNA、MMP-9和VEGF表達抑制滑膜成纖維細胞的增殖和侵襲。這一發(fā)現(xiàn)為特異性干預TLR4基因或研制TLR4特異性抑制劑治療RA提供了理論依據(jù)。