林明，姜路花，余挺,*

（1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，杭州 310058；2.淳安縣農業(yè)技術推廣中心，杭州 311700）

果實在存貯及轉運過程中由采后病害造成的損失巨大[1]，其中擴展青霉（Penicillium expansum）被普遍認為是梨病害的主要病原菌[2-3]?，F(xiàn)階段，主要采用化學殺菌劑來防治該病害，然而過度使用化學殺菌劑會危害人體健康，造成環(huán)境污染及產(chǎn)生抗藥性等問題[4]。當前，歐盟已禁止化學殺菌劑在核果類果實中的應用[5]，因此，尋找安全無毒、環(huán)境友好和高效抑菌的化學殺菌劑替代品已成為現(xiàn)階段的迫切需求[6]。將拮抗微生物用于果實采后病害的生物防治被視為最有可能替代化學殺菌劑的方法之一[1]。拮抗酵母具有安全無毒、使用方便及遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點，使其商品化運用成為可能。目前，國際上已有多種拮抗酵母的生物防治微生物制品獲準注冊生產(chǎn)，包括 Nexy、AQ10、Shemer及 Sporodex等[7-9]。為進一步提高拮抗酵母的生物防治效果，研究人員進行了多種嘗試，包括逆境脅迫處理、培養(yǎng)條件優(yōu)化、分離逆境條件拮抗菌種及表達外源基因等[3，10-12]。其中，隨著分子技術的高速發(fā)展，將表達產(chǎn)物具有直接抑菌效力及能提高拮抗微生物抗逆性等外源基因定向轉化拮抗酵母，逐漸成為生物防治領域的研究熱點。畢赤酵母具有遺傳操作簡單、外源基因表達水平高且穩(wěn)定、表達產(chǎn)物可加工及修飾等特點受到研究者青睞，目前已有多種抗菌肽在畢赤酵母中成功表達。BANANI等[13]將堿性絲氨酸蛋白酶基因轉化到畢赤酵母表達系統(tǒng)中，誘導表達后能有效抑制蘋果4種采后病原真菌的致病性。KUDDUS等[14]報道，將抗菌肽基因snakin-1轉化畢赤酵母能有效抑制革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及假絲酵母等的生長。

抗菌肽是生物體特定基因編碼產(chǎn)生的一類具有抑菌作用的小分子多肽，對細菌具有高效光譜的殺滅能力，同時對真菌、病毒、原蟲等也具有較強抑制作用[15-16]。抗菌肽在果蔬病害防治方面的應用前景廣闊，微摩爾級即可有效地抑制病原菌，同時不易產(chǎn)生耐藥性等特性使得抗菌肽的作用日益突出。如：ZHANG等[17]發(fā)現(xiàn)，從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）培養(yǎng)基中提取胰蛋白酶水解產(chǎn)物的多肽能有效抑制葡萄的腐??；LIU等[18]經(jīng)體內和體外研究發(fā)現(xiàn)，CgPep33抗菌肽能有效地抑制草莓中灰葡萄孢的孢子萌發(fā)。然而受限于現(xiàn)階段技術水平的落后，直接提取抗菌肽存在難度大、成本高、提取率低等劣勢，以及許多天然抗菌肽會存在輕微的細胞毒性和溶血活性等安全問題，從而限制了抗菌肽的大規(guī)模使用。

本研究所選擇的抗菌肽Ace-AMP1具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，沸水浴10 min后仍具有活性；Ace-AMP1對多種采后病原微生物具有高效的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，Ace-AMP1對12種測試的真菌均具有抑制效果，其中對鏈格孢菌（Alternaria brassicola）的半抑制質量濃度（50%inhibiting concentration,IC50）低至 2.5 μg/mL，對灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的半抑制質量濃度（IC50）低至3 μg/mL，同時，人體細胞溶血活性測定結果證實Ace-AMP1對人體細胞不具有毒性[19-20]。本研究根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性對Ace-AMP1抗菌肽目的基因進行優(yōu)化，并將其構建到pPICZα A表達載體中，轉化畢赤酵母GS115高效表達，以期能夠得到高效表達Ace-AMP1的重組菌株及提高重組酵母在采后病害防治上的效果，為抗菌肽在抑制果實采后病害的開發(fā)利用方面奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用水果為成熟度相近、大小相等、無明顯受損和無病害的，采摘于商業(yè)成熟期的水晶梨（Pyrus pyrifolia）。在實驗開始前，水晶梨先用體積分數(shù)為0.1%的次氯酸鈉溶液漂洗1 min，然后再用自來水沖洗干凈，自然晾干后置于相同處理過的塑料筐中，備用。

表達載體pPICZα A及GS115酵母菌株購買于美國Invitrogen公司；大腸埃希菌菌株DH5α購買于南京諾唯贊（Vazyme）生物科技有限公司；青霉病病原菌（Penicillium expansum）為本實驗室保存菌種。

限制性內切酶XhoⅠ、NotⅠ、SacⅠ及T4連接酶購買于英濰捷基（上海）貿易有限公司；PCR試劑2×Phanta Max Master Mix購買于南京諾唯贊（Vazyme）生物科技有限公司；質粒DNA小量提取試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒均購買于美國Axygen公司；博來霉素購買于上海翊圣生物科技有限公司；一抗c-Myc Tag單克隆抗體購買于美國Invitrogen公司；二抗以辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗鼠IgG（H+L）購買于上海碧云天公司。胰蛋白胨、酵母提取物等其他試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的合成

為保證目的基因N端的天然活性，并根據(jù)表達載體序列信息，在目的基因前端序列添加Kex2酶切位點；同時根據(jù)畢赤酵母GS115密碼子偏好性，對Ace-AMP1序列進行改造，在改造后的序列Kex2酶切位點前端添加XhoⅠ和NotⅠ作為限制性內切酶位點，優(yōu)化后的目的基因序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并將合成序列連接至pUC-SP載體上。

1.2.2 重組表達載體的構建

將含有優(yōu)化目的基因的pUC-SP載體和表達載體pPICZα A分別用XhoⅠ和NotⅠ進行雙酶切，所得產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用DNA凝膠回收試劑盒回收優(yōu)化后的目的片段和表達載體。將回收后的目的片段通過T4連接酶構建到pPICZα A質粒上，并將構建好的載體導入DH5α大腸埃希菌感受態(tài)細胞中，37℃培養(yǎng)45 min，然后涂布于低鹽的LB+博來霉素平板（博來霉素質量濃度為25 μg/mL）上，37℃過夜培養(yǎng)至形成單菌落，最后分別挑取單菌落進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）檢測及后續(xù)測序鑒定。PCR反應條件為：95℃預變性30 s；95℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；最后，72℃延伸5 min。5′AOX1特異性引物為：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′。3′AOX1特異性引物為：5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′。構建成功的重組表達載體命名為pPICZα A/Ace-AMP1，并用于下一步轉化實驗。

1.2.3 重組GS115/Ace-AMP1酵母的轉化與鑒定

將構建好的重組表達載體pPICZα A/Ace-AMP1和未導入抗菌肽的空載體pPICZα A用SacⅠ酶切處理后，取10 μL線性化的載體與80 μL制備好的GS115感受態(tài)細胞混勻并轉移至電轉杯中，根據(jù)Bio-Rad電轉儀設置的程序電擊轉化至感受態(tài)酵母細胞內，迅速添加1 mol/L山梨醇1 mL，28℃靜置1 h，取200 μL電擊轉化液均勻涂布于YPD+博來霉素抗性平板（博來霉素質量濃度為100 μg/mL）上，并于28℃恒溫條件下培養(yǎng)至形成單菌落。分別挑取單菌落進行酵母基因組的提取，并將其作為反應模板，引物、PCR反應體系與條件同1.2.2。將目的基因已正確整合到酵母基因組的重組轉化菌株命名為GS115/Ace-AMP1，空載體轉化菌株命名為GS115/pPICZαA。

1.2.4Ace-AMP1在酵母中的表達與鑒定

挑取經(jīng)過驗證的目的基因已整合到酵母基因組的重組菌株GS115/Ace-AMP1和空質粒對照菌株GS115/pPICZα A單菌落，于25 mL BMGY液體培養(yǎng)基中以30℃、250 r/min振蕩過夜培養(yǎng)；離心收集菌體沉淀，用BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌液至D（600 nm）=1.0，進行誘導表達。每隔24 h添加甲醇至終體積分數(shù)為1%，持續(xù)誘導120 h；每隔12 h取1 mL樣品測定抗菌肽表達水平。

將樣品以8 000g離心10 min，分別收集上清液和沉淀，每個取樣時間點取50 μL上清液，用Braford法檢測樣品中的抗菌肽濃度。同時，將得到的上清液按照9∶1的比例加入100%三氯乙酸，混勻后置于冰上沉淀過夜，離心后加入預冷的丙酮振蕩重懸，再次離心后加入十二烷基磺酸鈉樣品緩沖液重懸，沸水浴處理10 min，取10 μL樣品進行Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE），電泳后的凝膠進行轉膜處理，然后加入Western封閉液緩慢搖動，室溫封閉1 h后進行一抗和二抗孵育，最后進行蛋白檢測。

將沉淀用無菌水清洗2遍，加入Yeast RNAprep Buffer試劑去除酵母細胞壁，然后在RNAiso試劑（RNAiso Plus）的作用下裂解細胞，釋放核酸，再分別加入三氯甲烷和異丙醇提取酵母RNA，最后用75%乙醇對RNA進行清洗。得到的RNA用PrimeScriptTM反轉錄成cDNA，并將其作為實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-timequantitativepolymerase chain reaction,RT-qPCR）模板，采用2－ΔΔCT方法定量檢測Ace-AMP1抗菌肽基因表達量。定量用特異性引物為內參基因引物GS115Actin（F：5′-GGTTCCCACTTATTTCCCAG-3′；R：5′-GCTCCTTCAGTTTTTCCGTCT-3′），抗菌肽基因引物為Ace-AMP1（F：5′-CCTGTAGATGTTTGG TAGGGG-3′；R：5′-GCATTGAATACGGGGACG-3′）。

1.2.5 重組GS115/Ace-AMP1酵母生物防治效果檢測

重組轉化株GS115/Ace-AMP1、對照菌株GS115/pPICZα A及畢赤酵母GS115在酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium,YPD）上活化2代，然后按照上述方法誘導培養(yǎng)后，離心收集菌體沉淀，用無菌水充分重懸洗滌菌體2次，最后用血球計數(shù)板計數(shù)，調整菌懸液至1×107mL－1。

將本實驗室低溫保存的擴展青霉病原菌活化2代，然后轉接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（potato dextrose agar medium,PDA）上，28℃恒溫培養(yǎng)至形成孢子，用經(jīng)過無菌處理的接種環(huán)刮取適量分生孢子于無菌水中，最后用血球計數(shù)板計數(shù)，調整分生孢子懸液至1×104mL－1。

實驗用水晶梨先經(jīng)0.1%次氯酸鈉溶液漂洗，再用自來水沖洗干凈，自然晾干，備用。每個果實用無菌處理的打孔器在赤道部位制造4個傷口，每個傷口盡量保持寬5 mm、深5 mm。分別往傷口中添加50 μL無菌水（CK）、1×107mL－1的GS115菌懸浮液、1×107mL－1的 GS115/pPICZα A 菌懸浮液、1×107mL－1的GS115/Ace-AMP1菌懸浮液。自然晾干2 h后，每個傷口接種30 μL 1×104mL－1的青霉病原孢子懸浮液。選取9個梨果實作為一個處理置于飼料框中，用保鮮膜封口，保持90%的濕度環(huán)境，25℃恒溫貯藏48 h后觀察并記錄果實的發(fā)病率及病斑直徑。每個實驗設置3個平行。

2 結果

2.1 Ace-AMP1目的基因優(yōu)化及合成

以在APD（Antimicrobial Peptide Database）數(shù)據(jù)庫中得到的Ace-AMP1抗菌肽作為母體肽，根據(jù)畢赤酵母GS115密碼子偏好性對Ace-AMP1進行優(yōu)化并合成，合成產(chǎn)物連接到pUC-SP載體上，測序驗證后表明，XhoⅠ、NotⅠ、Kex2酶切位點及Ace-AMP1目的基因已正確連接。

2.2 pPICZα A/Ace-AMP1重組表達載體的構建

雙酶切后的線性化載體和Ace-AMP1經(jīng)切膠回收，并用T4連接酶過夜連接。構建好的表達載體轉化大腸埃希菌，挑取單菌落經(jīng)PCR擴增，結果如圖1所示：有4個單菌落出現(xiàn)與理論值一致的單一條帶，2個單菌落pPICZα A載體沒有被完全切開。將與理論值一致的4個單菌落的PCR結果進一步測序驗證，結果表明，Ace-AMP1已正確構建到pPICZαA表達載體上。

圖1 重組質粒pPICZαA/Ace-AMP1的PCR鑒定結果Fig.1 Identification result of pPICZα A/Ace-AMP1 recombinant plasmid by PCR

2.3 重組載體的轉化和鑒定結果

重組表達載體pPICZα A/Ace-AMP1和未導入抗菌肽的空載體pPICZα A電轉化畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞后，均勻涂布于含有博來霉素的抗性平板上，分別挑取單菌落連同畢赤酵母GS115一起進行PCR擴增，結果如圖2所示：畢赤酵母GS115、導入空質粒后的GS115及導入重組表達載體后的GS115均能在2 000 bp處檢測到條帶，說明所用的通用引物5′AOX1和3′AOX1能識別GS115基因組其他位點，但是只在導入空質粒和導入抗菌肽重組質粒的GS115畢赤酵母中出現(xiàn)大小不同、與預期相符的2條條帶，說明空載體pPICZα A和重組表達載體pPICZα A/Ace-AMP1已連接到GS115基因組中，進一步經(jīng)測序驗證表明結果正確。

圖2 重組菌株GS115/Ace-AMP1的PCR鑒定結果Fig.2 Identification result of GS115/Ace-AMP1 recombinant strain by PCR

2.4 Ace-AMP1在酵母中的表達與鑒定結果

挑取誘導表達后的含抗菌肽重組基因的GS115和誘導表達后的僅含空質粒的GS115測定抗菌肽表達水平，結果如圖3所示：誘導84 h后，導入Ace-AMP1組的蛋白質量達到最大值，為109 μg/mL，而對照組則一直處于較低水平。

圖3 重組酵母GS115/Ace-AMP1的蛋白質含量Fig.3 ProteincontentofGS115/Ace-AMP1recombinantstrain

每隔12 h取樣，經(jīng)RT-qPCR定量檢測誘導表達后的重組GS115/Ace-AMP1酵母中Ace-AMP1抗菌肽基因的表達量，結果如圖4所示：從12 h到108 h，抗菌肽Ace-AMP1基因均能上調表達，說明甲醇能顯著誘導目的基因表達；在72 h時，Ace-AMP1基因表達量達到最大值，為誘導前的5.4倍。

圖4 重組酵母GS115/Ace-AMP1的Ace-AMP1基因相對表達量Fig.4 Relative expression amount of Ace-AMP1 for the recombinant strain GS115/Ace-AMP1

將取樣得到的上清液經(jīng)蛋白質印跡法（Western-blotting）檢測，結果如圖5所示：GS115畢赤酵母和導入空質粒的GS115/pPICZα A畢赤酵母在膠體中不存在條帶，而導入抗菌肽后的重組GS115/Ace-AMP1畢赤酵母則存在一條分子質量約為12.5 kDa的條帶，與預期結果相符。該實驗結果進一步證明抗菌肽已成功導入畢赤酵母GS115中，并能夠成功表達。

圖5 重組菌株GS115/Ace-AMP1的蛋白質印跡法鑒定結果Fig.5 Identification result of GS115/Ace-AMP1 recombinant strain by Western-blotting

2.5 重組GS115/Ace-AMP1酵母對梨青霉病的防治效果

將重組轉化株GS115/Ace-AMP1、對照菌株GS115/pPICZα A及畢赤酵母GS115誘導培養(yǎng)后，用調整到1×107mL－1的酵母菌懸液處理梨果實傷口，觀察其對青霉病的影響。結果（圖6A）表明，GS115/Ace-AMP1重組畢赤酵母能夠有效地抑制青霉病的發(fā)生，經(jīng)重組酵母GS115/Ace-AMP1懸浮液處理后的梨實驗組，青霉病的發(fā)病率降低至41%，顯著低于對照組，而用無菌水、GS115及含空質粒的GS115/pPICZα A酵母菌懸浮液處理后無顯著變化，發(fā)病率分別為75%、71%、71%。梨果實病斑直徑也具有相同的變化趨勢，重組酵母GS115/Ace-AMP1處理的實驗組病斑直徑最小，僅為3.2 mm，相較于無菌水、GS115和導入空質粒GS115/pPICZα A處理的對照組，病斑直徑分別下降65%、54%和61%（三者病斑直徑分別為9.4、7.0和8.2 mm）（圖6B）。青霉病發(fā)病率和病斑直徑的結果說明，導入抗菌肽Ace-AMP1后能顯著提高GS115的抑菌效果。

圖6 重組酵母GS115/Ace-AMP1對梨青霉病的防治效果Fig.6 Control efficiency of recombinant strain GS115/Ace-AMP1 on Penicillium expansum in pear fruit

3 討論

生物防治技術以其安全無毒、對環(huán)境友好、不易產(chǎn)生耐藥性等特點逐漸受到人們的重視。作為一種新型采后保鮮技術，其作用模式主要是利用微生物之間的營養(yǎng)與空間競爭，分泌水解酶、殺菌物質和誘導果實產(chǎn)生抗性等來抑制病原微生物的生長，從而減小果蔬采后腐爛發(fā)生的概率[5，21-22]。畢赤酵母表達系統(tǒng)以其遺傳穩(wěn)定、不產(chǎn)生毒素、自身分泌蛋白較少及能對異源基因進行正確的翻譯、加工和修飾等優(yōu)點[13]，成為應用最為廣泛的真核表達系統(tǒng)之一。抗菌肽Ace-AMP1來自于可食性洋蔥種子，且已有研究證實對人體細胞無毒害作用，因而其安全性得到保障；同時，其對病原真菌的抑制效果達到微摩爾級，展現(xiàn)出在生物防治領域的巨大潛力。然而，天然抗菌肽生產(chǎn)成本高、提取工藝煩瑣等劣勢限制了其應用與推廣，同時拮抗菌的生物防治效力與化學殺菌劑相比仍存在較大差距，因此，通過基因工程方法將抗菌肽導入拮抗菌中表達，以提高抗菌肽的產(chǎn)率，以及利用其高效抑菌能力，提高重組菌株的生物防治效力。本研究首次將Ace-AMP1轉化到畢赤酵母GS115中，獲得了高效表達抗菌肽Ace-AMP1且具有優(yōu)異抑菌效果的GS115/Ace-AMP1菌株，為該抗菌肽的大規(guī)模生產(chǎn)及抗菌肽在抑制果實采后病害的開發(fā)利用方面奠定了基礎。

將重組酵母GS115/Ace-AMP1誘導培養(yǎng)后，在84 h時取樣檢測發(fā)現(xiàn)，其蛋白質質量濃度能達到109 μg/mL。而KUDDUS等[14]報道，將抗菌肽基因snakin-1轉化畢赤酵母后其提取量為40 μg/mL；任雪艷[23]將Cecropin A轉化畢赤酵母后其蛋白質質量濃度為14.247 μg/mL。本實驗結果表明，重組酵母GS115/Ace-AMP1能高效表達抗菌肽Ace-AMP1，為抗菌肽的大規(guī)模生產(chǎn)提供了物質基礎。

將重組酵母GS115/Ace-AMP1用于梨采后的病害防治實驗可以發(fā)現(xiàn)：GS115畢赤酵母和轉化空質粒后GS115/pPICZα A畢赤酵母的發(fā)病率與無菌水處理的對照組相比沒有明顯的差異，而導入抗菌肽之后的重組GS115/Ace-AMP1畢赤酵母能顯著抑制梨青霉病的發(fā)生，發(fā)病率較無菌水處理組下降了34%；病斑直徑變化規(guī)律與發(fā)病率基本一致；然而，由于畢赤酵母與病原真菌之間存在拮抗作用，自身也具有一定的生物防治效力，因而GS115與對照組之間存在著明顯差異，但導入空質粒之后，其病斑直徑與GS115無差異?？咕腁ce-AMP1作為能直接抑菌的物質導入GS115后，使得重組酵母病斑直徑顯著減小65%。綜合發(fā)病率與平均病斑直徑的結果表明，導入抗菌肽Ace-AMP1后，重組GS115/Ace-AMP1畢赤酵母的生物防治效力得到提升。

目前，抗菌肽主要用于醫(yī)藥、食品和飼料添加劑等領域。SHAYKHIEV等[24]發(fā)現(xiàn)，LL-37能通過刺激呼吸道上皮細胞的增殖來加速傷口的愈合。FERREIRA等[25]發(fā)現(xiàn)，乳酸鏈球菌肽（nisin）能顯著降低干酪中產(chǎn)單核細胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）的數(shù)目，延長干酪的保質期。但抗菌肽在果蔬采后病害防治領域的研究鮮有報道。本研究通過將抗菌肽導入拮抗酵母進一步提高其生物防治效力的方法，能為果蔬采后病害新型生物防治技術的研究提供新思路和奠定理論基礎。

本研究仍存在一些不足：一是雖然所選的Ace-AMP1基因來源于可食性的洋蔥種子組織，且已被證實對人體細胞無毒害作用，同時畢赤酵母表達系統(tǒng)已被批準作為一種動物飼料添加劑[26]，但表達后的Ace-AMP1的安全性仍需進一步探究；二是現(xiàn)階段抗菌肽的作用機制仍沒有得到統(tǒng)一，普遍認為其依賴于與靶細胞膜的相互作用，使得膜通透性改變，打破酸堿平衡、滲透壓平衡等，而除了作用于細胞膜外，認為其還能作用于胞內靶標，從而干擾細胞代謝[27]，因此，今后需進一步探討導入抗菌肽后的重組酵母的相關抑菌機制。

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