王麗麗，楊軍國，林清霞，項麗慧，宋振碩，張應(yīng)根，陳林

（福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，福建 福安 355015）

有機酸是組成茶葉香氣和滋味的主要成分之一，占茶葉干物質(zhì)總量的3%左右[1]。茶葉中有機酸種類較多，茶葉（湯）中經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有機酸有40余種，其中茶湯中有10余種，香氣成分中有30余種[2]。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，茶葉中的有機酸具有諸多生物學活性：一方面，可介導合成酚類、氨基酸、酯類和芳香化合物等物質(zhì)，參與茶樹的新陳代謝，并且可作為生化反應(yīng)中糖類分解的中間產(chǎn)物；另一方面，可有效協(xié)同增強茶多酚激活α-淀粉酶和胰蛋白酶活性表達，增強茶多酚的抗氧化活性，促進兒茶素在人體中吸收轉(zhuǎn)化，具有減輕關(guān)節(jié)炎、痛風等生理功能[1-3]。因此，定性與定量分析茶葉中的有機酸，是對茶葉生產(chǎn)過程中品質(zhì)調(diào)控研究必不可少的內(nèi)容，在茶葉生物學活性研究中亦具有重要的意義。

已報道的茶葉有機酸分析方法有酸堿滴定法、氣相色譜法、離子交換色譜法、毛細管電泳法和高效液相色譜法等[2-4]，其中：酸堿滴定法靈敏度低，氣相色譜法需進行復雜衍生化處理，離子交換色譜法存在無機陰離子干擾，毛細管電泳法重現(xiàn)性較差，而液相色譜法具有操作簡單、靈敏度高、分離效果好的特點，是目前最廣泛使用的檢測手段。在所建立的茶葉有機酸高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）檢測中，測定組分主要包括草酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸等，還包括乳酸、酒石酸、抗壞血酸、富馬酸、甲酸、丙酮酸、α-酮戊二酸等[5-8]。本文在前人研究的基礎(chǔ)上綜合了茶葉中可能檢測到的10種有機酸，期望建立一種多茶類通用的有機酸同步快速HPLC檢測方法，以期對茶葉風味品質(zhì)調(diào)控起到一定的指導作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

綠茶、白茶、烏龍茶（清香型鐵觀音）、紅茶和普洱茶，自制。

1.1.2 試劑

磷酸（H3PO4，優(yōu)級純，上海國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈（HPLC級，美國Fisher Scientific公司）；10種有機酸標準品：D/L-酒石酸（純度99.8%）、乙酸（純度99.7%）、富馬酸（純度99.8%）、乳酸（純度91.2%）、琥珀酸（純度99.5%）（以上均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司），草酸和抗壞血酸（純度100%，中國食品藥品檢定研究院），檸檬酸（純度100%，中國藥品生物制品檢定所），甲酸溶液[HPLC級，含量49%～51%（T），美國Fluka公司]，L-蘋果酸（純度94.2%，美國ChromaDex公司）。

1.1.3 儀器

美國Agilent1260型液相色譜系統(tǒng)，包括四元泵（G1311C VL）、標準自動進樣器（G1329B）、柱溫箱（G1316A）和二極管陣列檢測器（G1315D VL）；AL204電子天平（美國Mettler Toledo公司）；ACD-0502-U實驗室超純水系統(tǒng)（重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）；TSKgel ODS-100V色譜柱（4.6 mm×250mm，5 μm，日本Tosoh公司）；PB-21酸度計（配PYASI電極，德國Sartious公司）；PES水系針式濾器（孔徑0.45 μm，天津津騰實驗設(shè)備有限公司）等。

1.2 HPLC方法的建立

1.2.1 有機酸標準品儲備液的配制

準確移取甲酸、乳酸、乙酸標準品，以超純水超聲溶解并定容至10 mL，分別配制成1.5、5.0和10.0mg/mL的標準品儲備液；分別精密稱取草酸、D/L-酒石酸、抗壞血酸、檸檬酸、琥珀酸、L-蘋果酸、富馬酸等標準品50.0 mg（精確至0.1 mg），以超純水超聲溶解并定容至10 mL，除富馬酸配制成1 mg/mL的標準品儲備液外，其余均配制成5 mg/mL的儲備液。上述溶液均過0.45 μm水系針式濾器，分裝，于－20℃保存，備用。

1.2.2 色譜條件優(yōu)化

分別從檢測波長（200～400 nm）、流動相配比[流動A相（H3PO4水溶液）的pH值為2.27、2.16、2.05，相應(yīng)配制的體積分數(shù)為0.06%、0.10%、0.14%；流動A相與B相（50%乙腈水溶液）洗脫比例]、柱溫（36、38、40、42 ℃）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）等方面考察10種有機酸在TSKgel ODS-100V色譜柱上的分離效果，從而確定適宜的色譜條件。

1.2.3 方法學考察

從標準曲線、檢測限、定量限、精密度、重復性、穩(wěn)定性、回收率等方面對適宜的色譜條件予以考察，驗證其運行效果。具體步驟如下：取各有機酸標準品儲備液適量，按一定比例稀釋，制成一系列不同質(zhì)量濃度的標準品溶液，采用上述色譜條件進樣分析，進樣量10 μL。以進樣的質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，建立回歸方程，確定線性范圍。將各標準品儲備液稀釋成很低的濃度后進樣，分別以3倍和10倍信噪比（S/N）測得檢測限和定量限。根據(jù)標準曲線確定的線性范圍，取各有機酸儲備液適量，混勻，制成含草酸、D/L-酒石酸、甲酸、L-蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸質(zhì)量濃度分別為0.125、0.365、1.200、0.500、0.125、0.700、1.800、0.590、1.225、0.025μg/mL的混合標準品溶液（以下簡稱“有機酸混標”），于4℃條件下保存，備用。取該有機酸混標上樣分析，連續(xù)進樣5次，計算各組分峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation,RSD），考察精密度。平行制備有機酸混標3份，分別進樣，計算各組分峰面積的RSD，考察重復性。對同一有機酸混標，分別于配制后的0、2、4、8、12、14和24 h時進樣，計算組分峰面積的RSD，考察穩(wěn)定性。取已知含量的茶樣1份，分別添加質(zhì)量濃度不等的有機酸混標3份，上樣分析，測定添加前后茶樣中各標準品含量，考察回收率。

1.3 方法驗證性試驗

準確稱取磨碎茶樣0.30 g，加45 mL純水，渦旋混勻，沸水浴45 min，冷卻過濾，用超純水稀釋1倍，過0.45 μm水系針式濾器后上樣檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 檢測波長的確定

通過二極管陣列檢測器（diode array detector,DAD）在波長200～400 nm范圍內(nèi)對有機酸混標進行光譜掃描。結(jié)果（圖1）顯示，抗壞血酸在245 nm附近有較大吸收值，其余9種有機酸均在210 nm附近吸收值較大，而且流動A相在紫外區(qū)幾乎無吸收。因此，設(shè)置DAD為雙波長同時檢測，分別在210和245 nm處檢測抗壞血酸，在210 nm處檢測其他有機酸。

圖1 10種有機酸的紫外光譜掃描圖Fig.1 Ultraviolet spectra of 10 organic acids

2.1.2 流動相配比的確定

分別以0.06%、0.10%、0.14%的H3PO4水溶液做流動A相，測得溶液pH值依次為2.27、2.16、2.05，并設(shè)置柱溫40℃，流速1 mL/min，有機酸混標溶液進樣量10 μL，等度洗脫12 min，在210 nm波長下檢測，考察流動A相的不同pH值對有機酸混標中各組分保留時間的影響。結(jié)果（圖2）表明，因試驗所設(shè)pH值（2.05～2.27）的范圍波動較小，故僅對琥珀酸和富馬酸的保留時間稍有影響，且隨流動相pH值的升高，總體檢測時間稍有縮短?？紤]到此色譜柱pH值范圍為2.0～7.5，選擇pH值2.16與2.27均可，因此，本試驗選擇pH值2.16即以0.10%H3PO4水溶液做流動A相。然而，因后續(xù)茶樣測試采用序列連續(xù)自動進樣，在試驗中發(fā)現(xiàn)上一針茶樣中殘留的雜質(zhì)對后續(xù)進樣的色譜分離效果造成了不良影響，如出現(xiàn)峰型變胖、雜峰較多、兩峰之間或以上相互重疊、組分分離度變差等現(xiàn)象（圖3），因此在0.10%H3PO4水溶液等度洗脫12 min后，以50%乙腈水溶液（流動B相）進行梯度洗脫[100%A（12 min）→0%A（17 min）→0%A（25 min）→100%A（30 min）→100%A（33 min），后運行2 min]，可有效清除上一針茶樣中保留時間較長的殘留雜質(zhì)。

2.1.3 柱溫的確定

設(shè)置柱溫36、38、40、42 ℃，以0.10%H3PO4水溶液做流動A相，采取梯度洗脫方式，其余色譜條件不變，進樣分析，考察不同柱溫對各組分保留時間的影響。結(jié)果（圖4）表明，柱溫為40℃時，分離10種有機酸所需檢測時間最短，且柱溫越低柱壓越大，色譜柱壽命也相應(yīng)縮短，因此，選用40℃柱溫最佳。

2.1.4 流速的確定

設(shè)置流速0.8、1.0、1.2 mL/min，以0.10%H3PO4水溶液做流動A相，采取梯度洗脫方式，其余色譜條件不變，進樣分析，考察不同流速對各組分保留時間的影響。結(jié)果（圖5）表明，隨著流速的提高，各組分保留時間明顯縮短，總的檢測時間變短，但在1.2 mL/min流速下柱壓最高且D/L-酒石酸和甲酸之間的分離度變差，因此，選用1.0 mL/min流速為宜。

圖2 流動A相的不同pH值對10種有機酸保留時間的影響Fig.2 Effect of mobile phase A with different pH values on the retention time of 10 organic acids

圖3 序列進樣下茶樣中10種有機酸的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of 10 organic acids in tea during sequence sampling

由此確定分離10種有機酸適宜的色譜條件為：采用TSKgel ODS-100V色譜柱，流動相由0.10%H3PO4水溶液（A相）和50%乙腈水溶液（B相）組成，以 100%A（0 min）→100%A（12 min）→0%A（17 min）→0%A（25 min）→100%A（30 min）→100%A（33 min）進行梯度洗脫，后運行2 min，柱溫40℃，流速1.0 mL/min，檢測波長210 nm和245 nm。在此色譜條件下，有機酸混標中各組分均達到基線分離，分離效果良好（圖6）。

圖4 不同柱溫對10種有機酸保留時間的影響Fig.4 Effect of different column temperatures on the retention time of 10 organic acids

圖5 不同流速對10種有機酸保留時間的影響Fig.5 Effect of different flow rates on the retention time of 10 organic acids

2.2 方法學考察結(jié)果

2.2.1 標準曲線、檢出限和定量限

取不同質(zhì)量濃度的標準品溶液適量，按試驗確立的適宜色譜條件進樣分析，測得各組分峰面積，繪制標準曲線。其保留時間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限和定量限見表1。結(jié)果顯示，所有回歸方程的相關(guān)系數(shù)在0.999 5以上，表明10種有機酸在所測濃度范圍內(nèi)進樣濃度X與峰面積Y呈良好的線性關(guān)系。

圖6 在適宜色譜條件下10種有機酸的HPLC圖Fig.6 HPLC chromatogram of 10 organic acids under the suitable chromatographic condition

2.2.2 精密度、重復性和穩(wěn)定性

在上述確立的適宜色譜條件下進行方法學考察，結(jié)果見表2。精密度試驗和重復性試驗顯示，所有組分峰面積的RSD均小于1%；穩(wěn)定性試驗顯示，在室溫條件下同一混標溶液中抗壞血酸濃度呈直線下降，24 h后含量減少約50%，表明其穩(wěn)定性較差，其余組分峰面積RSD均小于4%，穩(wěn)定性良好；回收率試驗表明，各組分回收率為97%～116%。由此表明所建立的高效液相色譜法精密度和重復性良好，回收率較好，在室溫條件下混標溶液中除抗壞血酸外其余組分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合高效液相色譜測定要求。

表1 標準品的回歸方程Table 1 Regression equation of standards

表2 精密度、重復性、穩(wěn)定性與回收率試驗Table 2 Tests on accuracy,repeatability,stability and recovery%

2.3 方法驗證性試驗結(jié)果

按1.3節(jié)試驗方法提取和測定茶樣3次，得到的色譜圖如圖7所示，依據(jù)標準曲線計算各類茶提取液中有機酸含量，結(jié)果見表3?？梢钥闯?，在上述適宜的色譜條件下10種有機酸組分可得到較好的分離。從表3還可以看出，各茶樣中有機酸總量約占其干物質(zhì)的2%～5%，其中紅茶有機酸總量最高，琥珀酸和乳酸占其總量的50%以上，白茶的有機酸總量次之，乳酸和乙酸是其主要成分，烏龍茶的有機酸含量最低。推測茶類間有機酸含量差異的原因可能與其發(fā)酵程度和原料嫩度相關(guān)，相比其他茶類，紅茶發(fā)酵程度最高，而制作烏龍茶（鐵觀音）采用的鮮葉為對夾二至四葉或一芽三、四葉，嫩度均比綠茶和白茶低。

圖7 綠茶樣中10種有機酸的HPLC圖Fig.7 HPLC chromatogram of 10 organic acids in green tea samples

表3 茶樣中10種有機酸質(zhì)量分數(shù)Table 3 Content of 10 organic acids in teasmg/g

3 討論與結(jié)論

本文采用DAD檢測器對200～400 nm范圍內(nèi)全紫外波段掃描發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸的最大吸收波長在245 nm附近，不同于其他9種有機酸（在210 nm附近），鑒于茶樣中抗壞血酸含量較低，為提高檢測準確性，故選用245 nm作為抗壞血酸的檢測波長，將在此波長下測得的峰面積用于定量計算，這與喬方等[9]選用的波長相同，與文獻[10]采用的波長254 nm較為接近，而多數(shù)研究推薦210 nm[11-13]，即與其他有機酸的測定波長一致，推測主要出于檢測便捷性考慮。此外，抗壞血酸在室溫條件下很不穩(wěn)定，穩(wěn)定性試驗表明24 h后其含量降低約50%，因此為獲得可靠的測試結(jié)果，極有必要低溫保存該標準品溶液及所測茶樣。更值得一提的是，以0.10%H3PO4水溶液做流動相，在等度洗脫12 min后就可分離茶葉中的10種有機酸，但由于茶樣本身基質(zhì)復雜，在序列進樣中設(shè)置靠前的茶樣里一些水溶性雜質(zhì)會與后續(xù)所進茶樣中的有機酸組分重疊，導致其分離效果變差。因此，為消除此不良影響，本試驗先后嘗試用不同體積分數(shù)甲醇水溶液和乙腈水溶液洗脫茶樣中的雜質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10%～90%甲醇仍不足以洗脫雜質(zhì)，而50%乙腈梯度洗脫可有效洗去雜質(zhì)，使受測試樣品相互不受影響。這與劉晨明等[14]用乙腈來洗脫培養(yǎng)液中絕大部分保留時間較長的物質(zhì)，從而避免干擾下一個樣品的測定方法一致。

綜上可見，親水性的TSKgel ODS-100V色譜柱可用于茶葉中有機酸的分離檢測，其適宜的色譜條件為：以0.10%H3PO4水溶液（A相）和50%乙腈水溶液（B相）為流動相，洗脫梯度為100%A（0 min）→100%A（12 min）→0%A（17 min）→0%A（25 min）→100%A（30 min）→100%A（33 min），后運行2 min，柱溫為40℃，流速為1.0 mL/min，DAD在雙波長210和245 nm下同時檢測。用該方法可在35 min內(nèi)同時分離測定茶葉中的10種有機酸。

參考文獻(References):

［1］劉盼盼,鐘小玉,許勇泉,等.茶葉中有機酸及其浸出特性研究.茶葉科學,2013,33(5):405-410.LIU P P,ZHONG X Y,XU Y Q,et al.Study on organic acids contents in tea leaves and its extracting characteristics.Journal of Tea Science,2013,33(5):405-410.(in Chinese with English abstract)

［2］譚和平,葉善蓉,陳麗,等.茶葉中有機酸的測試方法概述.中國測試技術(shù),2008,34(6):77-80.TAN H P,YE S R,CHEN L,et al.Determination overview of organicacidsin tea.ChinaMeasurement&Testing Technology,2008,34(6):77-80.(in Chinese with English abstract)

［3］何水平,郭春芳,孫云.茶葉有機酸的研究進展.亞熱帶農(nóng)業(yè)研究,2015,11(1):63-67.HE S P,GUO C F,SUN Y.Research progress of organic acids in tea.Subtropical Agriculture Research,2015,11(1):63-67.(in Chinese with English abstract)

［4］張光軍,許建文,丁明玉.離子交換色譜法同時分析綠茶中有機酸和無機陰離子的含量.新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報,2002,19(1):36-38.ZHANG G J,XU J W,DING M Y.Simultaneous analysis with ion-exchange chromatography for the contents of organic acids and inorganic anions in green tea.Journal of Xinxiang Medical College,2002,19(1):36-38.(in Chinese with English abstract)

［5］何水平,郭春芳,孫云,等.白茶中的有機酸高效液相色譜分析方法的建立.中國茶葉加工,2015(3):37-42.HE S P,GUO C F,SUN Y,et al.Determination of organic acids in white tea by HPLC method.China Tea Processing,2015(3):37-42.(in Chinese with English abstract)

［6］張靜,蔣華軍,劉仲華,等.親水性C18硅膠反相色譜柱同時分離測定紅茶中的有機酸.食品安全質(zhì)量檢測學報,2014,5(8):2476-2481.ZHANG J,JIANG H J,LIU Z H,et al.Simultaneous separation and determination of organic acids in black tea by high performance liquid chromatography using polarenhanced C18column.Journal of Food Safety and Quality,2014,5(8):2476-2481.(in Chinese with English abstract)

［7］袁玲,黃建安,龔志華,等.茯磚茶有機酸反相高效液相色譜分析方法建立及其應(yīng)用.中國農(nóng)學通報,2011,27(30):246-252.YUAN L,HUANG J A,GONG Z H,et al.Study on development and application technology of analysis method for organic acid in Fu-brick tea by RP-HPLC.Chinese AgriculturalScienceBulletin,2011,27(30):246-252.(in Chinese with English abstract)

［8］丁玲,屠幼英,陳曉敏.高效液相色譜測定緊壓茶中有機酸條件研究.茶葉,2005,31(4):224-227.DING L,TU Y Y,CHEN X M.Simultaneous determination of various organic acids in compressed tea by high performance liquid chromatography.Journal of Tea,2005,31(4):224-227.(in Chinese with English abstract)

［9］喬方,黃略略,方長發(fā),等.不同產(chǎn)區(qū)的妃子笑及懷枝荔枝的甜酸滋味物質(zhì)比較及電子舌分析.食品與生物技術(shù)學報,2012,31(9):984-990.QIAO F,HUANG L L,FANG C F,et al.Comparison of taste-related compounds and analysis using electronic tongue of Feizixiao and Huaizhi lychee fruits from different planting area.Journal of Food Science and Biotechnology,2012,31(9):984-990.(in Chinese with English abstract)

［10］劉小莉,周劍忠,董明盛,等.高效液相色譜-二極管陣列檢測器法測定水蜜桃中水溶性有機酸和維生素的含量.南京農(nóng)業(yè)大學學報,2009,32(1):151-154.LIU X L,ZHOU J Z,DONG M S,et al.Determination of water-soluble organic acids and vitamins in juicy peach using HPLC-DAD.Journal of Nanjing Agricultural University,2009,32(1):151-154.(in Chinese with English abstract)

［11］MAGDALENA J S,AGNIESZKA Z G.Analysis of antioxidant activity,chlorogenic acid,and rutin content ofCamelliasinensisinfusions using response surface methodology optimization.Food Analytical Methods,2014,7(10):2033-2041.

［12］KELEBEK H,SELLI S,CANBAS A,et al.HPLC determination of organic acids, sugars, phenolic compositions and antioxidant capacity of orange juice and orange wine made from a Turkish cv.Kozan.Microchemical Journal,2009,91(2):187-192.

［13］楊焱,谷鎮(zhèn),劉艷芳,等.反相高效液相色譜法測定食用菌中7種有機酸的研究.菌物學報,2013,32(6):1064-1070.YANG Y,GU Z,LIU Y F,et al.Determination of seven organic acids in edible fungi by reversed-phase high performance liquid chromatography.Mycosystema,2013,32(6):1064-1070.(in Chinese with English abstract)

［14］劉晨明,曹宏斌,曹俊雅,等.梯度洗脫高效液相色譜法快速檢測厭氧菌代謝物中的有機酸.分析化學研究報告,2006,34(9):1231-1234.LIU C M,CAO H B,CAO J Y,et al.Fast detection of organic acid in anaerobe medium with gradient elution-high performance liquid chromatography.Chinese Journal of Analytical Chemistry,2006,34(9):1231-1234.(in Chinese with English abstract)