高曉月，董彬，張超，付建新，胡紹慶，趙宏波*，梁立軍

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，杭州 311300；2.浙江理工大學(xué)建筑工程學(xué)院，杭州 310018）

桂花（Osmanthus fragrans）是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，是集綠化、美化和香化為一體的園林樹(shù)種，在中國(guó)有悠久的栽培歷史，深受人們喜愛(ài)。桂花（本文指的是秋桂）的花在開(kāi)放前需要一段時(shí)間的相對(duì)低溫，并且持續(xù)一段時(shí)間才能發(fā)揮作用[1]。為了解桂花的開(kāi)花機(jī)制，研究花開(kāi)放過(guò)程中的控制基因就顯得尤為重要。

擴(kuò)展蛋白作為細(xì)胞壁松弛因子，在花開(kāi)放過(guò)程中調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)展，影響花開(kāi)放進(jìn)程[2]，其作用機(jī)制一般認(rèn)為是擴(kuò)展蛋白通過(guò)打斷細(xì)胞壁纖維素與半纖維素之間的非共價(jià)鍵，促使它們之間相互位移，從而引起細(xì)胞壁伸展[3]。植物擴(kuò)展蛋白家族由4個(gè)亞家族組成，分別命名為EXPA（α-expansin）、EXPB（β-expansin）、EXLA（expansin-like A）和EXLB（expansin-like B）[4]。研究表明，擴(kuò)展蛋白影響了種子的萌發(fā)[5]、根毛的起始和延長(zhǎng)[6]、莖和葉的生長(zhǎng)發(fā)育[7-8]、花粉管的延長(zhǎng)[9]、果實(shí)的成熟[10]等，幾乎參與了植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程。唐菖蒲（Gladiolus gandavensis）中的擴(kuò)展蛋白基因GgEXPA1[11]參與了花開(kāi)放進(jìn)程，在香石竹（Dianthus caryophyllus）和蠟梅（Chimonanthus praecox）中也發(fā)現(xiàn)了這種影響花開(kāi)放的基因[12-13]。擴(kuò)展蛋白家族的大多數(shù)基因受外界環(huán)境的調(diào)控，啟動(dòng)子中包含了相應(yīng)的響應(yīng)元件，因此，研究擴(kuò)展蛋白基因的啟動(dòng)子對(duì)于了解該基因的調(diào)控機(jī)制有重要意義。

本文選擇前期篩選獲得的3個(gè)與桂花花開(kāi)放緊密相關(guān)的擴(kuò)展蛋白基因OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1[14]，利用染色體步移法克隆啟動(dòng)子序列，分析啟動(dòng)子中包含的順式作用元件；同時(shí)，構(gòu)建啟動(dòng)子融合β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase,GUS）報(bào)告基因的表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草，利用組織化學(xué)染色觀察報(bào)告基因的表達(dá)，從而檢測(cè)該啟動(dòng)子的活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

以浙江農(nóng)林大學(xué)桂花資源圃栽種的桂花丹桂品種‘堰虹桂’（Osmanthus fragrans‘Yanhong Gui’）為實(shí)驗(yàn)材料，樹(shù)齡6—8年。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒及試劑

實(shí)驗(yàn)中所用的限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶、PremixTaq酶、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA純化試劑盒、DL2000標(biāo)志物、克隆載體pMD18-T、大腸埃希菌（Escherichia coli）DH5α、In-Fusion?HD克隆試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等均購(gòu)自TaKaRa公司（大連），X-gluc購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，pBI121菌液由浙江農(nóng)林大學(xué)觀賞植物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1啟動(dòng)子的克隆與調(diào)控元件分析

于2016年9月采集生長(zhǎng)健壯的桂花樹(shù)幼嫩葉片，采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide,CTAB）法提取基因組DNA。分別用平末端限制性?xún)?nèi)切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，構(gòu)建基因組酶切文庫(kù)。按照DNA純化試劑盒說(shuō)明書(shū)純化酶切產(chǎn)物，并用T4DNA連接酶將接頭序列添加至基因組DNA酶切片段的5′末端。接頭序列按照Genome Walker說(shuō)明書(shū)合成。分別以本課題組已獲得的OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1基因序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物OfEXPA2-GSP1/2、OfEXPA4-GSP1/2和OfEXLA1-GSP1/2，并結(jié)合2條簡(jiǎn)并引物AP1、AP2（表1）進(jìn)行2輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增。

以添加過(guò)接頭的基因組酶切文庫(kù)為預(yù)擴(kuò)增模板，使用接頭引物AP1與基因特異性引物GSP1進(jìn)行第1輪PCR。反應(yīng)體系：模板1 μL，簡(jiǎn)并引物AP1（10 μmol/L）1 μL，GSP1（10 μmol/L）1 μL，PremixTaq酶10 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 25 s，72 ℃退火30 s，7個(gè)循環(huán)；94 ℃變性25 s，67 ℃退火3 min，35個(gè)循環(huán)；67℃延伸7 min。將第1輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍作為模板，使用簡(jiǎn)并引物AP2與GSP2配對(duì)進(jìn)行第2輪PCR。反應(yīng)體系：模板 1 μL，接頭引物 AP2（10 μmol/L）1 μL，基因特異性引物 GSP2（10 μmol/L）1 μL，PremixTaq酶10 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性25 s，72 ℃退火3 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性25 s，67℃退火3 min，20個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶按TaKaRa公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收；連接反應(yīng)按照TaKaRa公司pMD18-T載體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；將連接后的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸埃希菌DH5α，并用氨芐霉素篩選，挑取白色單菌落進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增并送出測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAman軟件進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)正確的啟動(dòng)子序列采用植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫(kù)Plantcare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）在線(xiàn)預(yù)測(cè)分析可能存在的順式作用元件。

1.2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

植物表達(dá)載體pBI121是一個(gè)雙元載體，含有GUS基因系統(tǒng)和CaMV35S啟動(dòng)子。為了研究OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1啟動(dòng)子的功能，用其替換植物表達(dá)載體pBI121中的35S啟動(dòng)子，與GUS報(bào)告基因融合，構(gòu)建植物表達(dá)載體。用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切pBI121載體，純化產(chǎn)物。按照In-Fusion?HD克隆試劑盒說(shuō)明書(shū)分別設(shè)計(jì)3對(duì)上下游引物OfEXPA2-F/R、OfEXPA4-F/R及OfEXLA1-F/R（表1），以桂花基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后分別與pBI121酶切后的純化產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α，經(jīng)PCR鑒定后送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

表1 引物序列及用途Table 1 Primer sequences and their function

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草及GUS瞬時(shí)表達(dá)鑒定

將構(gòu)建好的各個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，以GV3101空菌株為陰性對(duì)照，含pBI121載體的菌株為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)攜帶有重組載體的菌株進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析。將煙草葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小塊后放入吸光度值為0.6的農(nóng)桿菌菌液中侵染10 min，用無(wú)菌濾紙將葉片表面的菌液吸干，將經(jīng)侵染的外植體置于被無(wú)菌水浸潤(rùn)的濾紙上，暗培養(yǎng)24 h后進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，用V（醋酸）∶V（乙醇）為3∶1的脫色液浸泡至陰性對(duì)照為白色時(shí)，用體視顯微鏡（ZEISS CL-6000）進(jìn)行觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子克隆

根據(jù)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增后，分別從EcoRⅤ酶切體系中得到3條較長(zhǎng)的片段（圖1），將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與基因序列拼接后，得到了OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1的啟動(dòng)子片段，長(zhǎng)度分別為1 108、808、945 bp。

2.2 啟動(dòng)子序列分析

采用Plantcare在線(xiàn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站對(duì)所得到的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，OfEXPA2啟動(dòng)子序列中含有大多數(shù)高等植物啟動(dòng)子具有的保守元件TATA盒（起始密碼子上游－94 bp）和CAAT盒（起始密碼子上游－179 bp），同時(shí)含有脫落酸響應(yīng)元件、MYB結(jié)合位點(diǎn)、多個(gè)光調(diào)控作用元件和參與晝夜節(jié)律調(diào)控的元件（圖2）。

圖1 桂花OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1啟動(dòng)子擴(kuò)增Fig.1 Amplification of OfEXPA2，OfEXPA4 and OfEXLA1 promoters from O.fragrans

對(duì)克隆的OfEXPA4啟動(dòng)子片段分析發(fā)現(xiàn)，該序列含有大多數(shù)高等植物啟動(dòng)子的基本元件TATA盒（起始密碼子上游－80 bp）和CAAT盒（起始密碼子上游－397 bp），在3′端還存在一個(gè)參與基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的5′-UTR Py-rich元件，除此之外，OfEXPA4啟動(dòng)子序列還含有多個(gè)光響應(yīng)順式作用元件、MYB結(jié)合位點(diǎn)、創(chuàng)傷誘導(dǎo)元件（圖3）。

利用啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)網(wǎng)站Plantcare上相關(guān)軟件對(duì)所得的OfEXLA1啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：該序列含有大多數(shù)高等植物啟動(dòng)子的基本元件TATA盒（起始密碼子上游－61bp）和CAAT盒（起始密碼子上游－27bp）。除了這些基礎(chǔ)元件外，在OfEXLA1啟動(dòng)子區(qū)域中，還發(fā)現(xiàn)了與激素調(diào)控有關(guān)的反應(yīng)元件：生長(zhǎng)素響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件。另外，在OfEXLA1啟動(dòng)子序列中還發(fā)現(xiàn)了熱激響應(yīng)元件HSE、MYB結(jié)合位點(diǎn)MBSⅡ和4個(gè)光響應(yīng)元件（圖4）。

圖2 OfEXPA2啟動(dòng)子序列及順式作用元件Fig.2 Sequences and cis-elements of OfEXPA2 promoter

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草葉片GUS組織化學(xué)染色

將構(gòu)建好的重組載體命名為OfEXPA2∶∶GUS、OfEXPA4∶∶GUS 和OfEXLA1∶∶GUS，并與 pBI121（CAMV35S∶∶GUS）空載體用凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，其中pBI121空載體為陽(yáng)性對(duì)照，GV3101為陰性對(duì)照，通過(guò)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)CAMV35S啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)化OfEXPA2∶∶GUS、OfEXPA4∶∶GUS、OfEXLA1∶∶GUS的煙草葉片經(jīng)GUS組織化學(xué)染色后均有藍(lán)色，其中OfEXPA2∶∶GUS 的染色最深，其次是OfEXLA1∶∶GUS，而OfEXPA4∶∶GUS染色最淺，而陰性對(duì)照沒(méi)有藍(lán)色（圖5）。說(shuō)明克隆的3種啟動(dòng)子均能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS的表達(dá)。

圖3 OfEXPA4啟動(dòng)子序列及順式作用元件Fig.3 Sequences and cis-elements of OfEXPA4 promoter

圖4 OfEXLA1啟動(dòng)子序列及順式作用元件Fig.4 Sequences and cis-elements of OfEXLA1 promoter

3 討論

高等植物基因的表達(dá)受到多種因素的影響，但是主要發(fā)生在調(diào)控水平上，受多種順式作用元件與反式作用因子的相互協(xié)調(diào)作用[15]；因此，了解基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)取決于對(duì)順式作用元件的分析[16]。在擴(kuò)展蛋白家族中，一些擴(kuò)展蛋白基因受激素的調(diào)控。MaExp1是香蕉（Musa acuminata）果實(shí)中的特異性基因，在MaExp1啟動(dòng)子中存在乙烯和生長(zhǎng)素的響應(yīng)元件，實(shí)驗(yàn)證明乙烯和生長(zhǎng)素能夠協(xié)同作用增強(qiáng)該基因的表達(dá)[17]。棉花（Gossypium barbadense）擴(kuò)展蛋白基因GbEXPA2啟動(dòng)子中有脫落酸和赤霉素響應(yīng)元件，外源赤霉素和脫落酸分別能夠上調(diào)和下降GbEXPA2的表達(dá)[18]。水稻中擴(kuò)展蛋白的活性在干旱脅迫下受到生長(zhǎng)素和脫落酸的誘導(dǎo)[19]。在洋桔梗（Eustoma grandiflorum）中，茉莉酸甲酯能夠促進(jìn)EgEXPA2、EgEXPA3和EgXTH1的表達(dá)，推動(dòng)花瓣中細(xì)胞壁的松弛，從而影響花開(kāi)放進(jìn)程[20]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在OfEXPA2啟動(dòng)子中含有脫落酸響應(yīng)元件，在OfEXLA1啟動(dòng)子中含有生長(zhǎng)素響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件。因此，推測(cè)OfEXPA2和OfEXLA1啟動(dòng)子能夠在激素的誘導(dǎo)下調(diào)控基因的表達(dá)。

除各類(lèi)激素元件外，OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1的啟動(dòng)子中還存在溫度、干旱脅迫等相關(guān)元件。在OfEXLA1啟動(dòng)子中存在熱激元件HSE，該元件能夠和參與熱脅迫的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，提高或降低植物的耐熱性[21]。除此之外，MBS元件、MBSⅡ元件分別與其中MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合參與干旱脅迫的響應(yīng)和類(lèi)黃酮的合成，其中MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布在植物中，并與脫落酸合成有關(guān)，能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用[22]。目前，參與類(lèi)黃酮合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子有AtMYB011/AtMYB012/AtMYB111[23]、EsMYB[24]等，參與干旱脅迫響 應(yīng) 的 有AtMYB002、AtMYB060/AtMYB094[25]、AtMYB096[26]等，其中，AtMYB102和AtMYB096受外源脫落酸的誘導(dǎo)。在本研究的OfEXPA2啟動(dòng)子中有脫落酸響應(yīng)元件，推測(cè)脫落酸響應(yīng)元件與MYB結(jié)合位點(diǎn)共同作用于OfEXPA2啟動(dòng)子，從而調(diào)控目的基因的表達(dá)。

通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子和GUS融合表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因煙草葉片研究發(fā)現(xiàn)，OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1啟動(dòng)子均能夠驅(qū)動(dòng)下游基因的表達(dá)。其中OfEXPA2啟動(dòng)子染色最深，OfEXPA4啟動(dòng)子染色最淺，可能是由于擴(kuò)展蛋白基因在不同的組織器官中的表達(dá)活性不同。

綜上所述，在本研究中啟動(dòng)子活性可能受到激素的誘導(dǎo)并使得相關(guān)擴(kuò)展蛋白基因的表達(dá)發(fā)生變化，影響花開(kāi)放。下一步研究將構(gòu)建脫落酸、生長(zhǎng)素、水楊酸響應(yīng)元件的缺失載體，分析不同缺失啟動(dòng)子片段誘導(dǎo)表達(dá)活性的強(qiáng)弱，從而確定激素對(duì)啟動(dòng)子的作用，期望通過(guò)對(duì)OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1啟動(dòng)子的深入研究來(lái)為揭示桂花花開(kāi)放的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

圖5 瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Detection result of transient expression

4 結(jié)論

本研究克隆了桂花花開(kāi)放相關(guān)基因OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1起始密碼子上游1 108、808、945 bp的啟動(dòng)子序列，在這3個(gè)啟動(dòng)子序列中均存在基本元件TATA盒和CAAT盒，以及激素誘導(dǎo)元件和干旱、高溫等多個(gè)與植物非生物脅迫相關(guān)的元件；通過(guò)煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)證明這3個(gè)啟動(dòng)子均能驅(qū)動(dòng)下游基因的表達(dá)。

參考文獻(xiàn)(References):

［1］王英,張超,付建新,等.桂花花芽分化和花開(kāi)放研究進(jìn)展.浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào),2016,33(2):340-347.WANG Y,ZHANG C,FU J X,et al.Progresses on flower bud differentiation and floweropening inOsmanthus fragrans.Journal of Zhejiang A＆F University,2016,33(2):340-347.(in Chinese with English abstract)

［2］VAN DOORN W G,VAN M U.Flower opening and closure:A review.Journal of Experimental Botany,2003,54(389):1801-1812.

［3］MCQUEEN-MASON S,COSGROVE D J.Disruption of hydrogen bonding between plant cell wall polymers by proteins that induce wall extension.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1994,91(14):6574-6578.

［4］KENDE H,BRADFORD K,BRUMMELL D,et al.Nomenclature for members of the expansin superfamily of genes and proteins.Plant Molecular Biology,2004,55(3):311-314.

［5］YAN A,WU M J,YAN L M,et al.AtEXP2is involved in seed germination and abiotic stress response inArabidopsis.PLoS One,2014,9(1):e85208.

［6］ZOU H Y,WENWEN Y H,ZANG G C,et al.OsEXPB2,aβexpansin gene,is involved in rice root system architecture.Molecular Breeding,2015,35:41.

［7］XING S C,LI F,GUO Q F,et al.The involvement of an expansin geneTaEXPB23from wheat in regulating plant cell growth.Biologia Plantarum,2009,53(3):429-434.

［8］GOH H H.The role of expansin in leaf development:A molecular genetics and AFM approach.Sheffield,UK:The University of Sheffield,2011.

［9］VALDIVIAER,STEPHENSONAG,DURACHKODM,et al.Class Bβ-expansins are neededfor pollenseparationandstigma penetration.Sexual Plant Reproduction,2009,22(3):141-152.

［10］PALAPOL Y,KUNYAMEE S,THONGKHUM M,et al.Expression of expansin genes in the pulp and the dehiscence zone of ripening durian(Durio zibethinus)fruit.Journal of Plant Physiology,2015,182:33-39.

［11］AZEEZ A,SANE A P,TRIPATHI S K,et al.The gladiolusGgEXPA1is a GA-responsive alpha-expansin gene expressed ubiquitously during expansion of all floral tissues and leaves but repressed during organ senescence.Postharvest Biology&Technology,2010,58(1):48-56.

［12］HARADAT,TORII Y,MORITAS,et al.Cloning,characterization,and expression of xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase and expansin genes associated with petal growth and development during carnation flower opening.Journal of Experimental Botany,2010,62(2):815-823.

［13］MA J,LI Z,WANG B,et al.Cloning of an expansin gene fromChimonanthus praecoxflowers and its expression in flowers treated with ethephon or 1-methylcyclopropene.HortScience,2012,47(10):1472-1477.

［14］羅云,張超,付建新,等.桂花擴(kuò)展蛋白基因家族的鑒定和表達(dá)分析.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2017,25(8):1289-1299.LUO Y,ZHANG C,FU J X,et al.Identification and expression analysis of expansin gene family inOsmanthusfragrans.Journal of Agricultural Biotechnology,2017,25(8):1289-1299.(in Chinese with English abstract)

［15］周小瓊,丁一瓊,左麗,等.大豆硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因GmSULTR1;2b啟動(dòng)子的克隆及活性分析.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,48(8):1650-1659.ZHOU X Q,DING Y Q,ZUO L,et al.Cloning and activity analysisofthe promoterofsulfate transportergeneGmSULTR1;2b.Scientia Agricultura Sinica,2015,48(8):1650-1659.(in Chinese with English abstract)

［16］YAMAGUCHI-SHINOZAKI K,SHINOZAKI K.Organization ofcis-acting regulatory elements in osmotic-and cold-stress-responsive promoters.Trends in Plant Science,2005,10(2):88-94.

［17］TRIVEDI P K,NATH P.MaExp1,an ethylene-induced expansin from ripening banana fruit.Plant Science,2004,167(6):1351-1358.

［18］LI Y,TU L L,YE Z X,et al.A cotton fiber-preferential promoter,PGbEXPA2,is regulated by GA and ABA inArabidopsis.Plant Cell Reports,2015,34(9):1539-1549.

［19］ZHAO M R,HAN Y Y,FENG Y N,et al.Expansins are involved in cell growth mediated by abscisic acid and indole-3-acetic acid under drought stress in wheat.Plant Cell Reports,2012,31(4):671-685.

［20］OCHIAI M,MATSUMOTO S,YAMADA K.Methyl jasmonate treatmentpromotesfloweropening ofcutEustomaby inducing cell wall loosening proteins in petals.Postharvest Biology&Technology,2013,82:1-5.

［21］李娟.水稻溫度誘導(dǎo)啟動(dòng)子POsUAH和POsACO1的結(jié)構(gòu)與功能研究.北京:中國(guó)科學(xué)院大學(xué),2014:20-24.LI J.Function analysis of two rice temperature-inducible promotersPOsUAHandPOsACO1.Beijing:University of Chinese Academy of Sciences,2014:20-24.(in Chinese with English abstract)

［22］AMBAWAT S,SHARMA P,YADAV N R,et al.MYB transcription factor genes as regulators for plant responses:an overview.Physiology and Molecular Biology of Plants,2013,19(3):307-321.

［23］STRACKE R,ISHIHARA H,HUEP G,et al.Differential regulation of closely related R2R3-MYB transcription factors controls flavonol accumulation in different parts of theArabidopsis thalianaseedling.The Plant Journal,2007,50(4):660-677.

［24］HUANG W J,SUN W,Lü H Y,et al.A R2R3-MYB transcription factor fromEpimedium sagittatumregulates the flavonoid biosynthetic pathway.PLoS One,2013,8(8):e70778.

［25］COMINELLI E,GALBIATI M,VAVASSEUR A,et al.A guard-cell-specific MYB transcription factor regulates stomatal movements and plant drought tolerance.Current Biology,2005,15(13):1196-1200.

［26］SEO P J,XIANG F N,QIAO M,et al.The MYB96 transcription factor mediates abscisic acid signaling during drought stress response inArabidopsis.Plant Physiology,2009,151(1):275-289.