，

缺氧缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain injury，HIBI)是新生兒死亡和神經(jīng)功能缺損的常見原因[1-2]。0.1%～0.2%新生兒出現(xiàn)圍生期窒息引起HIBI，約20%死亡，高達(dá)40%幸存者出現(xiàn)腦性麻痹、智力障礙或癲癇等[3]。已有研究證實(shí)，多種復(fù)雜病理事件，如細(xì)胞凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激和缺氧缺血腦損傷后興奮性毒性等均導(dǎo)致神經(jīng)元死亡并引發(fā)神經(jīng)功能障礙[4-5]，細(xì)胞凋亡是HIBI神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要形式[6]。因此對(duì)凋亡發(fā)生機(jī)制及抗凋亡藥物研究成為目前研究HIBI治療的新方法。丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate，EP)是丙酮酸酯的穩(wěn)定親脂性酯衍生物，具有抗氧化和清除自由基能力。已有研究提出EP通過多種機(jī)制，如炎癥反應(yīng)抑制、自由基清除、抗神經(jīng)元凋亡等參與對(duì)HIBI神經(jīng)損傷的保護(hù)作用，然而其保護(hù)作用所涉及相關(guān)機(jī)制及具體分子靶標(biāo)有待闡明。本研究通過建立新生大鼠HIBI模型，探討EP對(duì)HIBI新生大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響，并探討可能機(jī)制，以期為HIBI治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 昆明動(dòng)物研究所提供新生7 d齡Wistar大鼠幼仔105只，體重(13.6±1.7)g，雌雄比例約1∶1。將大鼠隨機(jī)分為3組，每組35只。假手術(shù)組(sham組)僅進(jìn)行中位頸部切口，未進(jìn)行缺氧缺血模型處理；模型組(HIBI組)根據(jù)動(dòng)物模型制備方法進(jìn)行缺氧缺血處理；丙酮酸乙酯處理組(EP組)于缺氧缺血處理30 min前進(jìn)行3 mg/kg EP腹膜內(nèi)注射[7]。EP購自Sigma-Aldrich，使用生理鹽水配制溶液。

1.2 HIBI模型 根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]，將大鼠用3%～4%異氟烷麻醉后，分離其左頸總動(dòng)脈并進(jìn)行6-0手術(shù)結(jié)扎。經(jīng)2 h恢復(fù)期后，將幼仔置于37 ℃水浴密閉缺氧箱中，持續(xù)給予8%O2和92%N2混合氣體進(jìn)行缺氧處理2.5 h。

1.3 海馬超微結(jié)構(gòu) 缺氧缺血后24 h，每組取5只大鼠幼仔迅速斷頭處死。取出腦組織，于4 ℃先用2.5%戊二醛溶液處理，之后用1%鋨酸固定，以乙醇和丙酮梯度脫水后，環(huán)氧樹脂包埋，獲得超薄切片后，進(jìn)行乙酸雙氧鈾和硝酸鉛雙重染色，在透射電子顯微鏡下觀察切片并拍照。

1.4 2，3，5-三苯基四氮唑-水合物(TTC)染色 缺氧、缺血后48 h，每組隨機(jī)取6只大鼠斷頭處死后取出腦，置于4 ℃的0.15 mol/L磷酸緩沖鹽溶液中冷凍5 min后，應(yīng)用Rat Brain Matrix(Zivic Instruments，USA)由前極向后沿冠狀面每隔2 mm取5個(gè)切片。將切片浸入溶解在0.15 mol/L磷酸緩沖鹽溶液的2%TTC(Sigma-Aldrich，USA)中，室溫孵育30 min，之后用4 ℃磷酸緩沖鹽溶液沖洗2次，再用4 ℃ 10%甲醛溶液中避光固定。正常腦組織TTC染色為紅色，梗死區(qū)域腦組織為白色，使用數(shù)碼相機(jī)獲得切片圖像后，使用Image J軟件測定梗死面積。以梗死面積占同側(cè)腦組織總面積的百分比作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

1.5 TUNEL檢測 缺氧缺血后36 h，每組隨機(jī)取8只大鼠斷頭處死后，取出腦在無菌條件下解剖海馬，使用Mcllwain切片機(jī)(Science Products GmbH，Switzerland)將海馬組織切成6 μm切片，于4%多聚甲醛中固定過夜，并在20%蔗糖磷酸緩沖鹽溶液浸漬2 d后，于30%蔗糖磷酸緩沖鹽溶液浸漬2 d，除去組織中的水分。根據(jù)制造商說明書，應(yīng)用ApopTag?熒光素原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(EMDMillipore，S7110)通過使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)修飾基因組DNA進(jìn)行海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的原位檢測。TUNEL標(biāo)記后，用DAPI(1∶500 000，Abcam 104139)標(biāo)記細(xì)胞核，并在激光掃描光譜共焦顯微鏡下進(jìn)行檢查。對(duì)3組海馬組織TUNEL陽性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的平均數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 雙重免疫熒光染色 在室溫下將1.5中腦組織切片用含5%FBS和0.1%Triton X-100的PBS封閉2 h后。將切片在室溫下與兔抗大鼠切割半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)多克隆抗體(1∶300)、大鼠抗神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)抗體(1∶300)于4 ℃孵育過夜。將切片用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次，每次5 min，在相應(yīng)二抗體(1∶500)中室溫孵育2 h，之后用DAPI復(fù)染2 min。經(jīng)過3次洗滌后，用Fluoromount G(Electron Microscopy Sciences，USA)蓋上，并干燥過夜。使用ZEISS HB050倒置顯微鏡系統(tǒng)進(jìn)行熒光顯微鏡成像，并由Image-Pro Plus 6.0軟件處理。

1.7 免疫組織化學(xué)染色 缺氧缺血24 h后，每組隨機(jī)取8只大鼠幼仔斷頭處死后取腦組織，在4%多聚甲醛中固定過夜。行常規(guī)脫水和石蠟包埋后，在大腦海馬區(qū)域獲得約4 μm厚度連續(xù)冠狀切片，脫蠟、干燥后，于常溫下保存，行海馬磷酸化(p)-蛋白激酶(Akt)、Bcl-2免疫組織化學(xué)染色。DAB顯色試劑盒購自上?；蚩萍加邢薰?，p-Akt、Bcl-2抗體購自Cell Signaling Technology。免疫組織化學(xué)陽性細(xì)胞計(jì)算方法如下：在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)海馬區(qū)域視野(放大倍數(shù)×400)，拍攝數(shù)字圖像并進(jìn)行染色，根據(jù)視野內(nèi)的平均光密度值(MOD)值進(jìn)行計(jì)算。

1.8 蛋白免疫印跡 缺氧缺血24 h后，每組隨機(jī)取8只大鼠幼仔斷頭處死后取腦組織，從左側(cè)海馬組織中提取總蛋白。使用補(bǔ)充有PMSF(Riche)的RIPA蛋白提取試劑裂解組織提取蛋白質(zhì)。4 ℃下12 000 r/min離心10 min后，通過10%SDS-PAGE分離上清液，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜在磷酸緩沖鹽溶液和5%脫脂乳中封閉1h，并用兔抗大鼠p-Akt、Bcl-2單克隆抗體(1∶200)和內(nèi)部對(duì)照兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜。將膜用HRP綴合的二抗在室溫下孵育1 h。使用Quantity One軟件(Life Technologies)評(píng)估相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)變化 sham組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常，神經(jīng)元細(xì)胞核呈橢圓形，核染色質(zhì)均勻分布；細(xì)胞可見線粒體、糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體。HIBI組觀察可見神經(jīng)元?dú)馕g變化，核不規(guī)則，核基質(zhì)氣蝕；細(xì)胞質(zhì)中線粒體發(fā)生氣蝕及腫脹，嵴斷裂，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、神經(jīng)纖維均顯示氣蝕變化；軸突神經(jīng)纖維出現(xiàn)明顯斷裂和溶解。EP組神經(jīng)元核呈橢圓形，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，線粒體稍有氣蝕和裂縫；富含糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)且排列規(guī)律。詳見圖1。

圖1 3組海馬超微結(jié)構(gòu)變化(乙酸雙氧鈾和硝酸鉛雙染，20 000×)

2.2 EP處理改善HIBI損傷后新生大鼠腦梗死情況 應(yīng)用TTC染色檢查腦梗死面積，分析EP對(duì)腦組織損傷的影響。HIBI組大腦皮層、紋狀體和海馬等區(qū)域顯示大片明顯的白色梗死區(qū)域，表明HIBI組腦組織損傷，EP組腦組織損傷顯著改善。詳見圖2 A。對(duì)腦組織梗死面積定量分析發(fā)現(xiàn)，與sham組比較，HIBI組梗死面積顯著增加(P<0.05)；與HIBI組比較，EP組梗死面積顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2 B。

與sham組比較，*P<0.05；與HIBI組比較，#P<0.05

2.3 EP處理改善HIBI損傷后新生大鼠海馬神經(jīng)元凋亡 TUNEL測定顯示，細(xì)胞死亡的熒光斑點(diǎn)主要對(duì)應(yīng)于神經(jīng)元細(xì)胞體的分布，見圖3 A。定量分析顯示，sham組TUNEL陽性細(xì)胞極少，而HIBI組陽性細(xì)胞顯著高于sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與HIBI組比較，EP組陽性細(xì)胞顯著降低(P<0.05)，見圖3 B。雙重免疫熒光染色顯示，HIBI導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)量減少，NeuN/cleaved caspase-3共定位陽性細(xì)胞(黃色)比例增加；EP組NeuN/cleaved caspase-3共定位陽性細(xì)胞比例降低，見圖3 C。定量分析顯示，HIBI組雙標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與HIBI組比較，EP組雙標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3 D。

2.4 海馬p-Akt、Bcl-2的免疫組織化學(xué)染色 3組海馬組織均觀察p-Akt、Bcl-2蛋白陽性表達(dá)，且陽性染色均位于細(xì)胞質(zhì)中。sham組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)p-Akt蛋白呈現(xiàn)弱陽性表達(dá)，且Bcl-2陽性細(xì)胞分布稀疏。HIBI組p-Akt蛋白陽性表達(dá)極弱，且Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)較少，染色淺，分布稀疏。EP組p-Akt和Bcl-2陽性表達(dá)均較強(qiáng)，Bcl-2免疫反應(yīng)性顆粒集中分布，呈深染色。詳見圖4 A。比較3組MOD值可見，HIBI組p-Akt和Bcl-2的MOD值均高于sham組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與HIBI組比較，EP組p-Akt和Bcl-2的MOD值顯著高于HIBI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖4 B、圖4 C。

2.5 海馬p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)水平 蛋白免疫印跡顯示，與sham組比較，HIBI組p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)水平增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與HIBI組比較，EP組p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖5。

A：HIBI損傷后，TUNEL染色(綠色)和DAPI(藍(lán)色)顯微照片，刻度尺為200 μm。B：TUNEL陽性細(xì)胞(綠色)定量分析。C：代表性雙重免疫熒光定位神經(jīng)元(NeuN，綠色)和cleaved caspase-3(紅色)，箭頭代表共定位細(xì)胞，刻度尺為100 μm。D：NeuN/cleaved caspase-3共定位陽性細(xì)胞(黃色)定量分析。與sham組比較，*P<0.05；與HIBI組比較，#P<0.05

A：大鼠海馬組織p-Akt和Bcl-2蛋白免疫組織化學(xué)分析；B：海馬組織p-Akt的MOD值；
C：海馬組織Bcl-2的MOD值。與sham組比較，*P<0.05；與HIBI組比較，#P<0.05

圖4免疫組織化學(xué)檢測海馬組織中p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)

A：p-Akt、Bcl-2蛋白免疫印跡電泳圖；B：p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)；C：Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)。與sham組比較，*P<0.05；與HIBI組比較，#P<0.05

3 討 論

海馬是HIBI動(dòng)物模型對(duì)損傷最敏感的部位。有研究報(bào)道，缺氧缺血可引起新生大鼠海馬部位大量神經(jīng)元凋亡，且凋亡持續(xù)時(shí)間較長[9-10]。本研究采用經(jīng)典的Rice法制作缺血HIBI模型，通過透射電子顯微鏡觀察新生大鼠海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)，sham組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常，而HIBI組神經(jīng)元呈氣蝕性改變，提示HIBI導(dǎo)致海馬神經(jīng)元損傷。TTC染色顯示，HIBI組新生大鼠缺血半球表現(xiàn)出明顯的腦梗死現(xiàn)象。提示HIBI模型建立成功，且引起海馬神經(jīng)元損傷。

為確定缺血缺氧后腦組織海馬神經(jīng)元凋亡情況，本研究應(yīng)用TUNEL法，并通過標(biāo)記神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞凋亡標(biāo)記物cleaved caspase-3和成熟神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN進(jìn)行雙重免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)HIBI組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增加，且凋亡細(xì)胞主要位于神經(jīng)元。提示HIBI是通過使海馬神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致腦組織損傷。

已有研究顯示，EP對(duì)新生大鼠HIBI的腦組織有保護(hù)作用[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EP組神經(jīng)元?dú)馕g性變化減少，神經(jīng)元受損情況改善腦梗死面積顯著低于HIBI組，提示EP處理對(duì)新生大鼠腦組織損傷有保護(hù)作用。TUNEL檢測和雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示，EP組TUNEL陽性染色的凋亡細(xì)胞顯著降低，且NeuN/cleaved caspase-3共定位陽性細(xì)胞比例顯著降低，表明EP對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用主要是通過減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，EP減少細(xì)胞炎癥因子分泌、抑制細(xì)胞凋亡，改善由于氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷，從而對(duì)多種內(nèi)臟器官起到保護(hù)作用。然而，EP對(duì)缺血缺氧后神經(jīng)細(xì)胞凋亡抑制作用的相關(guān)機(jī)制尚不完全明確。

目前認(rèn)為，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)/Akt信號(hào)通路作為經(jīng)典的抗凋亡、促存活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在HIBI后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過程中起重要調(diào)控作用[12]。當(dāng)PI3-K構(gòu)象發(fā)生改變時(shí)，Ser473和Thr308磷酸化產(chǎn)生p-Akt。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血時(shí)Akt被激活[13]。Li等[14]通過建立新生大鼠缺血缺氧模型發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠大腦神經(jīng)元p-Akt陽性表達(dá)增加，復(fù)氧后4 h表達(dá)最高，之后逐漸降低，12 h左右逐漸下降至正常水平，表明在缺血缺氧后，PI3-K/Akt信號(hào)通路被激活，p-Akt表達(dá)增加，主要參與早期腦組織應(yīng)激反應(yīng)。本研究在HIBI 24 h后，通過免疫組織化學(xué)和蛋白免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，sham組海馬組織p-Akt陽性細(xì)胞數(shù)目較少，且蛋白表達(dá)較弱， HIBI組p-Akt陽性細(xì)胞數(shù)目和蛋白表達(dá)增加，提示缺血缺氧過程中PI3-K/Akt信號(hào)通路激活，參與腦缺血缺氧引起的應(yīng)激反應(yīng)過程。然而，HIBI組p-Akt蛋白表達(dá)的增加與sham組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能與檢測時(shí)間有關(guān)。馮美江等[15]通過腦室預(yù)注射PI3-K/Akt特異性抑制劑發(fā)現(xiàn)，凋亡細(xì)胞顯著增加，提示PI3-K/Akt特異性抑制劑可阻斷海馬缺血耐受導(dǎo)致的神經(jīng)元保護(hù)作用，逆向證明PI3-K/Akt通路參與神經(jīng)元保護(hù)作用過程。本研究EP組p-Akt陽性細(xì)胞數(shù)目和蛋白表達(dá)顯著高于sham組和HIBI組，提示EP可能通過活化PI3-K/Akt信號(hào)通路，改善缺血缺氧引起的腦組織損傷。

凋亡是由基因調(diào)控的程序性和主動(dòng)性細(xì)胞死亡，由相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和凋亡基因共同決定。已有研究證實(shí)，p-Akt能通過調(diào)節(jié)其下游與抗細(xì)胞凋亡或促細(xì)胞存活相關(guān)因子Bcl-2、Bad或Bax等表達(dá)，參與抗凋亡過程[16-19]。Bcl-2是抗凋亡家族成員中重要的抗細(xì)胞凋亡基因，其可通過與Bax結(jié)合形成異構(gòu)二聚體或調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度等多種方式發(fā)揮抗凋亡作用[20-23]。有研究證實(shí)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[24-25]。本研究結(jié)果可見，EP組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著高于HIBI組。提示EP通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)而發(fā)揮其抗細(xì)胞凋亡作用，且這一作用與PI3-K/Akt信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上所述，缺血缺氧造模24 h后，新生大鼠表現(xiàn)出腦組織損傷且海馬神經(jīng)元凋亡。EP處理通過激活PI3-K/Akt信號(hào)通路、促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，緩解HIBI引起的神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。然而缺血缺氧引起腦組織損傷是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，所涉及信號(hào)通路及蛋白仍需進(jìn)行深入探究，以期為HIBI的治療提供理論依據(jù)。