沈茹 陳云明 楊曉紅 王曉巖

α地中海貧血（α-thalassemia）是因α珠蛋白基因變異，導(dǎo)致α珠蛋白缺乏或合成水平降低，以溶血、不同程度的小細(xì)胞低色素性貧血為表現(xiàn)的一種血紅蛋白?。╤emoglobinopathy）。α珠蛋白可構(gòu)成胎兒期及成年期最重要的3種血紅蛋白：血紅蛋白F（hemoglobin F，HbF）、血紅蛋白A（hemoglobin A，HbA）、血紅蛋白A2（hemoglobin A2，HbA2），正常人的2個α珠蛋白基因（αα/αα）分別從父、母兩方繼承。當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)超過100種與α地中海貧血相關(guān)基因型［1-2］，我國最為常見類型為東南亞缺失型α地中海貧血--SEA、右側(cè)缺失-α3.7、左側(cè)缺失-α4.2、非缺失型的血紅蛋白Constant-Spring（hemoglobin Constant-Spring，HbCS）和血紅蛋白 Quong-Sze（hemoglobin Quong-Sze，HbQS）［3］。α 地中海貧血患者的臨床表現(xiàn)根據(jù)基因型和變異數(shù)目不同而有所差異，從無癥狀攜帶到宮內(nèi)即死亡均可見，主要癥狀為貧血、肝脾腫大、黃疸等。地中海貧血主要發(fā)病地區(qū)集中于熱帶和亞熱帶，特別是地中海沿岸，我國發(fā)病率較高省份為廣西、廣東、云南，海南等?。?］。臨床上，對α地中海貧血的治療主要集中在對癥治療和對因治療，主要是輸血和干細(xì)胞移植兩方面，治療帶來的花費(fèi)大、并發(fā)癥多。因此，對特定人群的篩查、檢測，對于α地中海貧血的防控尤為重要，而實驗室診斷技術(shù)的進(jìn)步意義重大。本文分析和總結(jié)了近年來國內(nèi)外在α地中海貧血篩查及診斷方面的研究進(jìn)展，進(jìn)行簡要的綜述，以期加深對不同的實驗篩查、診斷技術(shù)及發(fā)展的了解，為各種技術(shù)方法的應(yīng)用和改進(jìn)拓寬視野和思路。

1 α地中海貧血的分子生物學(xué)機(jī)制

正常成年人血紅蛋白（HbA）的構(gòu)成主要為2條α珠蛋白鏈和2條β珠蛋白鏈（α2β2），胎兒血紅蛋白（HbF）由2條α珠蛋白鏈和2條γ珠蛋白鏈（α2γ2）構(gòu)成，編碼α鏈和γ鏈的基因2條來自父源、2條來自母源（αα/αα，γγ/γγ），編碼β鏈的基因則1條來自父源、1條來自母源（β/β）［5］。在胎兒及成人中，若α鏈在血紅蛋白中的含量降低，則β鏈或γ鏈的比例升高，而β鏈或γ鏈比例升高的血紅蛋白氧氣親和力高于正常的血紅蛋白，導(dǎo)致在外周毛細(xì)血管無法正常地將氧氣解離，進(jìn)而導(dǎo)致以缺氧為主要病理機(jī)制的一系列臨床癥狀［6］。

編碼α珠蛋白的基因位于16號染色體短臂末端臨近端粒13.3處，該區(qū)域包括2個α基因（α1、α2）、1個胚胎期基因ζ2、3個假基因及1個功能未知的基因。根據(jù)α鏈基因缺陷程度，分子生物學(xué)上將α地中海貧血分為2類：一類為缺失型α地中海貧血，由較大片段基因缺失導(dǎo)致；另一類為非缺失型α地中海貧血，由少數(shù)核苷酸插入、缺失、單個替換而導(dǎo)致。而在個體層面上，又可以分為2類：①α0地中海貧血，因缺失2個α基因（--/αα）導(dǎo)致α珠蛋白合成完全受阻所致，我國常見基因型為--SEA，而--THAI及--FIL較為罕見；②α+地中海貧血，由點(diǎn)突變導(dǎo)致的基因缺失或失活（-α/αα或ααND/αα），從而使部分α珠蛋白合成受阻，我國最常見的α+地中海貧血基因型為-α3.7、-α4.2缺失型突變以及HbCS、HbQS、血紅蛋白 Westmead（hemoglobin Westmead，HbWS）點(diǎn)突變［7］。臨床上一般根據(jù)α基因變異數(shù)目分為：靜止型（1個α基因異常）、標(biāo)準(zhǔn)型（2個α基因異常）、HbH病（3個α基因異常）、Hb Bart胎兒水腫綜合征（4個α基因異常）［8］。靜止型為無癥狀攜帶者；標(biāo)準(zhǔn)型和HbH病可因突變位置、類型、嚴(yán)重程度不同，出現(xiàn)貧血、肝脾腫大等一系列癥狀；Hb Bart最為嚴(yán)重，大多在孕中晚期流產(chǎn)或出生后短時間死亡，少數(shù)可在宮內(nèi)輸血、出生后輸血等方式下出生并生存至5歲左右，但生存質(zhì)量和預(yù)后極差。

2 α地中海貧血常用的診斷方法

2.1 篩查方法

臨床上高度懷疑為α地中海貧血的患者，常規(guī)的篩查檢測包括血常規(guī)檢查、紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查、紅細(xì)胞滲透脆性實驗、不穩(wěn)定血紅蛋白測定、血紅蛋白電泳等手段。在實際臨床中，考慮到敏感性、特異性，常用的篩查方法為血常規(guī)檢查和血紅蛋白電泳2種［9］。

2.1.1 血常規(guī)檢查

在臨床實踐中，血常規(guī)通常是貧血類疾病首選及基礎(chǔ)檢驗技術(shù)。α地中海貧血細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素性貧血，所以，如果血常規(guī)顯示MCV＜80 fL，MCH ＜ 27 pg［8］，即可診斷為小細(xì)胞低色素性貧血，而進(jìn)一步確診地中海貧血需與其他小細(xì)胞低色素性貧血如缺鐵性貧血、兒童鉛中毒、鐵幼粒細(xì)胞貧血等疾病相鑒別。紅細(xì)胞計數(shù)在地中海貧血患者及攜帶者中通常有一定程度的增高，網(wǎng)織紅細(xì)胞通常偏低，可以此進(jìn)行初步鑒別［10］?？紤]到血常規(guī)檢查的經(jīng)濟(jì)性，利用其作為初篩手段，具有重要的實用意義。

2.1.2 血紅蛋白電泳

對于 MCV＜80 fL，MCH＜27 pg的小細(xì)胞低色素性貧血，在進(jìn)行鑒別后如高度懷疑地中海貧血，可進(jìn)行血紅蛋白電泳進(jìn)行分析。在基因診斷廣泛應(yīng)用之前，血紅蛋白電泳首次在19世紀(jì)70年代被用于產(chǎn)前診斷，并被作為地中海貧血的確診實驗長達(dá)30余年［11］。常用的實驗室技術(shù)有：血紅蛋白醋酸纖維薄膜電泳、珠蛋白肽鏈聚丙烯酰胺凝膠電泳、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、全自動毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE）、全自動瓊脂糖電泳等。其中全自動瓊脂糖電泳為曾經(jīng)廣泛應(yīng)用的技術(shù)，其原理是根據(jù)各種不同類型的血紅蛋白分子攜帶的電荷不同、在電場中運(yùn)動速度不同，而分離不同類型的血紅蛋白。在電泳后，經(jīng)染色、脫色、固定，用掃描儀掃描電泳圖像，對各條電泳帶進(jìn)行定量分析，可測定HbA、HbA2、HbF、血紅蛋白H（hemoglobin H，HbH）、血紅蛋白 Bart（hemoglobin Bart，Hb Bart）以及其他異常的血紅蛋白的含量［12］。血紅蛋白電泳技術(shù)，可直接確診Hb Bart型α地中海貧血，其余類型均因血紅蛋白含量有限或不穩(wěn)定，難以直接觀察，無法直接診斷。但其對于β地中海貧血具有明確診斷意義，故可以作為排除性診斷的重要手段［13］。隨著分子生物學(xué)診斷方法進(jìn)步與發(fā)展，血紅蛋白電泳逐漸被基因診斷所替代，基因診斷現(xiàn)已成為最廣泛使用的確診實驗方法。但在缺乏相應(yīng)實驗室條件，或在復(fù)雜、非典型突變類型的診斷中，依然具有重要地位［14］。

2.2 分子生物學(xué)診斷方法

2.2.1 缺失型α地中海貧血的基因診斷

2.2.1.1 Southern印記雜交 Southern印記雜交原理為：首先用限制性內(nèi)切酶消化提取出的目的DNA；再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳取得DNA片段后，分離不同DNA片段至硝酸纖維膜上；用放射性同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針與酶切、分離后的DNA片段雜交；最后用同位素顯影技術(shù)，顯示不同酶切后的DNA片段的位置及其大小。該檢測技術(shù)可作為α珠蛋白基因片段缺失的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，因而可用作其他檢測手段的最終確診試驗［15］。該方法缺點(diǎn)為操作繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力，不利于大范圍開展，因此限制了其臨床診斷中的應(yīng)用。然而該檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，可作為PCR診斷結(jié)果的確診實驗。

2.2.1.2 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription quantitative，real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR） RT-qPCR 其原理為采用熒光染色檢測聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增后產(chǎn)物總量［16］。采用該方法檢測時，可用不同顏色的熒光素對PCR擴(kuò)增出的產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，從而同時顯示不同片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，可分辨正?；蛐汀㈦s合子和純合子［17］。該方法為目前確定樣品PCR產(chǎn)物總量最敏感、最特異的方法。Fallah等人［18］應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，對29例經(jīng)缺失基因測序后記過為陰性的疑似α地中海貧血患者的樣本進(jìn)行了檢測，其結(jié)果顯示29例樣本中均存在α珠蛋白基因缺失。

2.2.1.3 跨越斷裂點(diǎn)聚合酶鏈反應(yīng)（Gap-polymerase chain reaction，Gap-PCR） Gap-PCR最早由中國臺灣學(xué)者Chong等［19］建立，其原理為：設(shè)計2對或1對和1個單獨(dú)的引物，1對引物與缺失區(qū)域外側(cè)的基因序列互補(bǔ)，另1對或另1個單獨(dú)的引物與缺失區(qū)域內(nèi)的基因序列互補(bǔ)。若是正?；蛐突螂s合子，在缺失區(qū)域內(nèi)的引物能夠擴(kuò)增出片段；若是純合子，則缺失區(qū)域內(nèi)的引物不能擴(kuò)增出片段。而在缺失區(qū)域外側(cè)的1對引物，因缺失的基因使兩端DNA拉近，進(jìn)而擴(kuò)增成DNA片段［20］。該方法可鑒別出純合子患者、雜合子攜帶者和正常人。目前通過該手段可鑒別診斷8種以上常見的α地中海貧血基因［21］，且該技術(shù)容易開展，檢測過程簡單，需時短，成本低，便于臨床推廣，可廣泛應(yīng)用于缺失型α地中海貧血的基因檢測。但該手段的缺點(diǎn)為僅可檢測出已知突變，如存在未知的突變則會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，干擾臨床診斷［22］。

2.2.1.4 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA） MLPA技術(shù)是對樣品中的目標(biāo)序列定位和定量的檢測技術(shù)，該技術(shù)聯(lián)合基因雜交、連接酶催化反應(yīng)、PCR擴(kuò)增反應(yīng)等技術(shù)，可以同時檢測40多個不同核酸序列拷貝數(shù)的變化。在MLPA技術(shù)中，先設(shè)計2個寡核苷酸探針，與靶序列進(jìn)行雜交，之后利用連接酶的特性將兩部分探針連接?；谶B接反應(yīng)具備高度的特異性，即僅當(dāng)2個探針均與靶序列完全互補(bǔ)雜交，連接酶才能將兩段探針連接成一條完整的核苷酸鏈。如存在一個堿基的差別，都可以導(dǎo)致雜交不完全，連接反應(yīng)因此無法進(jìn)行。連接反應(yīng)完成后，用適當(dāng)引物擴(kuò)增，之后使用毛細(xì)管電泳分離產(chǎn)物，進(jìn)行軟件分析，根據(jù)圖像中擴(kuò)增峰與標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增峰的對比，根據(jù)擴(kuò)增峰改變情況判斷是否有突變存在［23］。Joly 等［24］運(yùn)用 MLPA，發(fā)現(xiàn)了一種長達(dá)285 kb的包含整個α珠蛋白基因家族的大片段缺失的缺失型α地中海貧血。Phylipsen等［25］亦應(yīng)用該技術(shù)，檢測出了11種新的缺失型α地中海貧血基因。該方法存在成本較高，且需要毛細(xì)管電泳儀等缺點(diǎn)，不便于推廣應(yīng)用。由于可以檢測出基因類型未知的α地中海貧血，MLPA可以作為常見方法檢測陰性但高度懷疑地中海貧血時的確診實驗。

2.2.2 非缺失型α地中海貧血的基因診斷

2.2.2.1 反向點(diǎn)雜交聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction-reverse dot blot，PCR-RDB） PCRRDB為臨床上廣泛應(yīng)用的檢測技術(shù)，其原理采取在尼龍膜上固定已知的寡核苷酸探針序列，與PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，后經(jīng)分析雜交信號可檢測出標(biāo)本的突變情況［26］。該方法優(yōu)點(diǎn)為一份標(biāo)本中如存在多種點(diǎn)突變可同時檢測出，郭廣洲等［27］應(yīng)用該檢測技術(shù)針對中國人常見的3種非缺失型α地中海貧血（αQSα，αCSα，αWSα）展開實驗，明確檢測出同一樣品在3個位置發(fā)生的點(diǎn)突變，并區(qū)分了純合子或雜合子突變，證實了該檢測方法簡單高效，符合臨床檢驗需求。

2.2.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP） PCR-RFLP原理為經(jīng)混合DNA限制性內(nèi)切酶與PCR產(chǎn)物，利用內(nèi)切酶高度識別切割特定DNA序列的特性，酶切得到不同DNA片段［28］。點(diǎn)突變型α地中海貧血將導(dǎo)致DNA序列改變使酶切位點(diǎn)改變，從而影響酶切片段的長度。通過凝膠電泳可鑒別DNA片段的數(shù)量及大小，與正常序列酶切片段電泳對比，據(jù)此判斷標(biāo)本是否存在點(diǎn)突變［29］。該法雖操作簡便，用時短，但因其不能檢測出具體點(diǎn)突變類型，限制了該技術(shù)在臨床上的推廣應(yīng)用。

2.2.2.3 基因芯片（gene chip） 基因芯片技術(shù)在80年代被提出，后于90年代該技術(shù)開始用于診斷地中海貧血。該技術(shù)原理是已知序列的靶核苷酸探針（基因探針）排列固定于硅片、玻片等支持物上，與經(jīng)過熒光或同位素標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，以芯片上不同位置出現(xiàn)的雜交信號的有無及強(qiáng)弱為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣品突變的定性及定量分析。Ye等［30］通過在實驗中計了常見的α、β地中海貧血基因的38個探針（其中包括地中海貧血的常見16種突變，-α3.7、-α4.2、--SEA、αQSα、αCSα），可在同一雜交反應(yīng)，即于一塊芯片中檢測出這些突變的存在與否，極大地簡化了實驗步驟，使地中海貧血在基因芯片檢測技術(shù)方面得到了極大的提升。該檢測具有快速，高效，高敏感性及高效性等特性，為臨床的α地中海貧血檢測提供了一種新型、快速的檢測手段。

2.2.2.4 DNA序列測定 DNA序列測定是基于一定手段測定標(biāo)本基因核苷酸序列，從而檢測出準(zhǔn)確點(diǎn)突變的位置及類型，是目前檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)［31］。該方法是利用DNA自動測序儀對標(biāo)本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行全自動化核苷酸序列測定，得出該標(biāo)本核苷酸序列，進(jìn)而分析取得點(diǎn)突變位置及類型。Galehdari等［32］采用RDB-DNA測序聯(lián)合技術(shù)對伊朗的1 241例標(biāo)本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)42種基因突變，高于PCR-RDB能發(fā)現(xiàn)的17種突變。目前該檢測技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于不僅可以檢測出已知突變，在一定程度上亦可檢測出未知突變［33］。DNA序列測定具有快速高效，結(jié)果準(zhǔn)確等特性，若今后出現(xiàn)可降低成本的技術(shù)改進(jìn)，則該技術(shù)在臨床檢測方面的推廣前景會進(jìn)一步增加。

3 小結(jié)與展望

隨著現(xiàn)代檢驗科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，α地中海貧血的實驗室診斷技術(shù)也在不斷改進(jìn)及提高，各種先進(jìn)的分子生物學(xué)科研成果正不斷轉(zhuǎn)化為可行的實驗室診斷技術(shù)。在眾多技術(shù)手段中，如何精準(zhǔn)選擇合適的方法，需要檢驗工作者結(jié)合疾病本身的特點(diǎn)、實驗室設(shè)備狀況以及當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)水平等條件，在綜合分析后進(jìn)行選擇。在所有的地中海貧血分型中，血常規(guī)、血紅蛋白電泳作為最基礎(chǔ)的篩查手段，對于疾病的初步鑒別診斷具有重要意義，是不可或缺的診斷手段。而進(jìn)一步的確診實驗，則要根據(jù)相關(guān)指南，用2種不同原理的方法進(jìn)行確診?？紤]到我國α地中海貧血以缺失突變?yōu)橹鞯那闆r，可優(yōu)先選用RT-qPCR以及Gap-PCR技術(shù)。若為陰性結(jié)果，則考慮進(jìn)行非缺失型突變相關(guān)的PCR-RDB、基因芯片、DNA測序等方法。對于實驗室檢測陰性但臨床高度懷疑的病例，則需要考慮未知突變、非典型突變的可能，應(yīng)當(dāng)根據(jù)實驗室條件不同，嘗試進(jìn)行MLPA和DNA測序、PCRRFLP、Southern blot等實驗?？紤]到MLPA、RCRRFLP、DNA測序技術(shù)現(xiàn)階段成本較高，Southern blot在基層實驗室開展困難等特點(diǎn)，臨床實踐中亦可將樣本送至有條件的實驗室協(xié)助診斷。同時，應(yīng)當(dāng)不斷追蹤國際國內(nèi)最新的技術(shù)進(jìn)展，以期將科研成果及時轉(zhuǎn)化為實用的技術(shù)，提高診斷方法的敏感性和準(zhǔn)確性，同時盡可能降低成本，為患者及臨床醫(yī)生提供更加可靠的實驗室診斷方法。