張黎仙，林 堃

1.福建省莆田市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心，福建莆田 351100；2.莆田學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，福建莆田 351100

珠蛋白生成障礙性貧血又稱為地中海貧血，主要是遺傳性α珠蛋白基因缺陷或者β珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致珠蛋白鏈缺如或合成不足所引起的溶血性貧血或病理狀態(tài)，所有類型的珠蛋白生成障礙性貧血都是常染色體隱性遺傳，并且可能發(fā)生不同的異常等位基因雜合的情況。重型α珠蛋白生成障礙性貧血可導(dǎo)致妊娠高血壓綜合征、死胎、產(chǎn)后大出血等，重型β珠蛋白生成障礙性貧血可導(dǎo)致死胎、新生兒死亡或出生后進(jìn)行性貧血[1]。珠蛋白生成障礙性貧血在我國主要高發(fā)于南方地區(qū)，尤其是在廣東、廣西、海南、福建發(fā)病率較高[2-3]。因此，為了深入了解莆田市珠蛋白生成障礙性貧血基因變異情況，本研究對(duì)3 151例疑似珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，進(jìn)一步探索莆田市珠蛋白生成障礙性貧血的診斷方案。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月至2021年10月在莆田學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)的3 151例疑似珠蛋白生成障礙性貧血者作為研究對(duì)象，其中男647例、女2 504例，年齡1個(gè)月至74歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫婦雙方只要有一方平均紅細(xì)胞體積(MCV)<80 fL和(或)平均血紅蛋白含量(MCH)<27 pg，視為初篩陽性，雙方需進(jìn)行血紅蛋白(Hb)電泳檢測(cè)；夫婦雙方MCV、MCH或Hb電泳結(jié)果陽性時(shí)，雙方行珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)(屬于珠蛋白生成障礙性貧血防控試點(diǎn)項(xiàng)目)。(2)篩查血紅蛋白電泳陽性，臨床上懷疑珠蛋白生成障礙性貧血的患者。(3)小細(xì)胞低色素性貧血，排除缺鐵性貧血，臨床上又高度懷疑珠蛋白生成障礙性貧血的患者。本研究經(jīng)莆田學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象或其家屬對(duì)本研究均知情同意。

1.2儀器與試劑 血常規(guī)檢測(cè)系統(tǒng)采用深圳邁瑞全自動(dòng)血液分析儀BC5800及其配套試劑；血紅蛋白電泳采用法國Sebia全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀CAPILLARYS2及其配套試劑；PCR基因擴(kuò)增儀采用美國伯樂T100，試劑采用潮州凱普公司提供檢測(cè)的試劑盒對(duì)標(biāo)本進(jìn)行基因診斷。

1.3方法

1.3.1基因提取 抽取研究對(duì)象EDTA-K2抗凝外周血2 mL，采用廣東潮州凱普公司提供的基因提取試劑盒提取DNA。

1.3.2珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷 使用廣東潮州凱普公司提供的珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷試劑盒，采用跨越斷點(diǎn)PCR法(Gap-PCR)檢測(cè)3種缺失型α珠蛋白生成障礙性貧血基因(--SEA、-α3.7、-α4.2)、3種突變型α珠蛋白生成障礙性貧血基因(CS、QS、WS)和17種β珠蛋白生成障礙性貧血基因(CD41-42/N、IVS-Ⅱ-654/N、-28/N、CD71-72/N、CD17/N、CD26/N或BE/N、CD43/N、-29/N、-30/N、CD31/N、-32/N、CD14-15/N、IVS-Ⅰ-1/N、IVS-Ⅰ-5/N、CAP+40-43/N、CD27/28/N、Int/N)。

1.3.3珠蛋白生成障礙性貧血基因測(cè)序 經(jīng)上述α及β珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)致病性突變的，而臨床上高度懷疑珠蛋白生成障礙性貧血的患者，進(jìn)行相應(yīng)α或β基因序列測(cè)定，檢測(cè)中國型Gγ+(Aγδβ)0和東南亞型HPFH基因缺失等，通過高通量測(cè)序檢測(cè)珠蛋白生成障礙性貧血基因序列，分析是否存在檢測(cè)范圍外的突變和缺失。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示。

2 結(jié) 果

2.1基因檢測(cè)結(jié)果 3 151例疑似珠蛋白生成障礙性貧血攜帶者，確診1 517例，檢出率為48.14%。其中 α珠蛋白生成障礙性貧血948例(62.49%)，β珠蛋白生成障礙性貧血553例(36.45%)，αβ復(fù)合珠蛋白生成障礙性貧血16例(1.05%)。

2.2α珠蛋白生成障礙性貧血基因型分析 對(duì)檢出的948例α珠蛋白生成障礙性貧血患者的基因型進(jìn)行具體分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共檢出14種基因組合類型，其中占比較高的基因型為--SEA/αα(75.21%)、-α3.7/αα(13.92%)；檢出α珠蛋白生成障礙性貧血純合子3例，基因型分別為-α3.7/-α3.7、ααQS/ααQS、-α4.2/-α4.2；雙重α雜合子共檢出5種基因型，其中-α3.7/--SEA占有相對(duì)較高的比例(2.11%)。另外，通過基因測(cè)序在莆田市首次檢出2例--THAI/αα罕見珠蛋白生成障礙性貧血基因型。各種基因突變型及構(gòu)成比見表1。

表1 α珠蛋白生成障礙性貧血基因型及構(gòu)成比

2.3β珠蛋白生成障礙性貧血基因型分析 對(duì)檢出的553例β珠蛋白生成障礙性貧血患者的基因型進(jìn)行具體分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共檢出14種基因組合類型，其中占比較高的基因型為βIVS-Ⅱ-654/βN(48.28%)、βCD41-42/βN(27.31%)。檢出多種少見組合類型，如βIVS-Ⅱ-654/βCD17、βCD41-42/βCD17、βCD41-42/β-28。各基因型及構(gòu)成比見表2。

表2 β珠蛋白生成障礙性貧血基因型及構(gòu)成比

2.4αβ復(fù)合珠蛋白生成障礙性貧血基因型檢測(cè)結(jié)果 檢出αβ復(fù)合珠蛋白生成障礙性貧血16例，包括8種類型，其中占比較高的基因型為-α3.7/αα+βCD41-42/βN及--SEA/αα+βIVS-Ⅱ-654/βN。各基因型及構(gòu)成比見表3。

表3 αβ復(fù)合珠蛋白生成障礙性貧血基因型及構(gòu)成比

3 討 論

成人主要血紅蛋白含兩條α珠蛋白鏈和兩條β珠蛋白鏈，具有攜氧功能，健康人自父母雙方各繼承2個(gè)α珠蛋白基因和1個(gè)β珠蛋白基因，合成正常量的α和β珠蛋白鏈，若自父母繼承了異常的珠蛋白基因，則造成α鏈或β鏈合成障礙從而導(dǎo)致珠蛋白生成障礙性貧血。根據(jù)缺乏的珠蛋白種類不同，分為α珠蛋白生成障礙性貧血和β珠蛋白生成障礙性貧血。α珠蛋白生成障礙性貧血可分為靜止型(1個(gè)α基因異常)、輕型(2個(gè)α基因異常)、中間型(3個(gè)α基因異常即HbH病)以及重型(4個(gè)α基因異常，即Hb Bart′s胎兒水腫綜合征)；β珠蛋白生成障礙性貧血也可分為輕型、中間型和重型。珠蛋白生成障礙性貧血是我國南方地區(qū)圍生兒死亡的主要原因之一，重型α珠蛋白生成障礙性貧血圍生兒多胎死腹中或產(chǎn)后幾小時(shí)死亡；重型β珠蛋白生成障礙性貧血患者常伴有嚴(yán)重的貧血癥狀，整個(gè)生命周期都需要依賴定期輸血和去鐵治療維持生命，給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力[4]。福建省是我國珠蛋白生成障礙性貧血高發(fā)省份之一，目前關(guān)于福建省珠蛋白生成障礙性貧血的研究資料相對(duì)較少。2013年徐兩蒲等[5]報(bào)道，福建人群珠蛋白生成障礙性貧血攜帶率高達(dá)4.41%。隨著東南沿海地區(qū)與兩廣地區(qū)交流互通，人口流動(dòng)增加，珠蛋白生成障礙性貧血基因變異類型趨向復(fù)雜化，為了完善、更新福建莆田地區(qū)珠蛋白生成障礙性貧血的流行病學(xué)資料，促進(jìn)優(yōu)生優(yōu)育，本研究對(duì)在莆田學(xué)院附屬醫(yī)院進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血檢測(cè)的人群做一個(gè)基因變異類型頻率分析。

本研究共檢出15種α珠蛋白生成障礙性貧血突變基因型，占比最高的基因型為--SEA/αα，其次為-α3.7/αα。這與本課題組2016年的研究成果相符[6]，但是新發(fā)現(xiàn)基因類型多了7種，體現(xiàn)了本地區(qū)突變類型復(fù)雜多樣性的特點(diǎn)。莆田市α珠蛋白生成障礙性貧血與本省其他市相比主要基因型相似[7-9]，與廣東[10]、廣西[11]、云南[12]、湖北武漢[13]等地的主要基因型也一致，但是與揭秋玲等[14]報(bào)道的海南省α珠蛋白生成障礙性貧血主要以-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/αα為主不同，差異稍大。由此可見，大部分南方地區(qū)α珠蛋白生成障礙性貧血基因型都是以--SEA/αα缺失型為主。同時(shí)，本次研究還發(fā)現(xiàn)，ααCS/αα在莆田市有較高的檢出率，提示CS位點(diǎn)可能是莆田市α珠蛋白生成障礙性貧血的主要基因突變點(diǎn)。本研究共檢出β珠蛋白生成障礙性貧血突變基因型14種，主要基因突變類型最常見的是βIVS-Ⅱ-654/βN，其次為βCD41-42/βN，分別占 β珠蛋白生成障礙性貧血基因型的48.28%、27.31%，另外檢出多種少見組合類型，如βIVS-Ⅱ-654/βCD17、βCD41-42/βCD17、βCD41-42/β-28，豐富了莆田市珠蛋白生成障礙性貧血基因突變譜。β珠蛋白生成障礙性貧血主要突變基因型與福建省其他市以往相關(guān)報(bào)道一致[15-16]，但與其他研究報(bào)道的廣東[10]、海南[14]的前3位基因型(βCD41-42/βN、βIVS-Ⅱ-654/βN、β-28/βN)，廣西[11]的前3位基因型(βCD41-42/βN、βCD17/βN、β-28/βN) ，云南[12]的前3位基因型(βCD26/βN、βCD17/βN、βCD41-42/βN)，四川[17]的前3位基因型(βCD17/βN、βCD41-42/βN、βIVS-Ⅱ-654/βCD17)相比差異甚大，進(jìn)一步佐證了β珠蛋白生成障礙性貧血具有更明顯的區(qū)域差異性。αβ復(fù)合珠蛋白生成障礙性貧血共檢出16例，共有8種組合類型，以-α3.7/αα+βCD41-42/βN居多。α珠蛋白生成障礙性貧血基因型以--SEA/αα為主，β珠蛋白生成障礙性貧血基因型以βIVS-Ⅱ-654/βN為主，按照遺傳定律αβ復(fù)合珠蛋白生成障礙性貧血基因型應(yīng)以--SEA/αα+βIVS-Ⅱ-654/βN為主，而在本次研究中僅排第2位，這可能與本次分析統(tǒng)計(jì)的αβ復(fù)合珠蛋白生成障礙性貧血數(shù)量不多有關(guān)。

現(xiàn)今主流的珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷試劑盒采用已知探針捕獲，導(dǎo)流雜交的原理，僅檢測(cè)23種常見珠蛋白生成障礙性貧血基因突變類型，即3種常見α珠蛋白生成障礙性貧血缺失型基因(--SEA、-α3.7、-α4.2)、3種α突變型基因(αWS、αQS、αCS)以及17種β珠蛋白生成障礙性貧血基因點(diǎn)突變。然而，珠蛋白生成障礙性貧血具有廣泛的遺傳異質(zhì)性，其基因突變類型繁多，在臨床工作中經(jīng)常遇到一些高度可疑的珠蛋白生成障礙性貧血患者使用常規(guī)方法卻得到未檢出突變的正常結(jié)果。呂榮鈺等[18]研究也發(fā)現(xiàn)，就算常規(guī)基因檢測(cè)陰性的人群中仍有1.8%的常規(guī)基因和 5.6%的罕見基因突變漏檢。莆田市珠蛋白生成障礙性貧血基因診斷范圍囿于常規(guī)檢測(cè)的23種，莆田市高發(fā)的罕見珠蛋白生成障礙性貧血類型是否存在未知新發(fā)突變目前尚不可知。隨著高通量技術(shù)(NGS)的發(fā)展以及生物信息學(xué)與大數(shù)據(jù)科學(xué)的交叉應(yīng)用，在NGS平臺(tái)進(jìn)行珠蛋白生成障礙性貧血基因序列分析成為可能。近年來研究也證實(shí)了NGS不僅可用于珠蛋白生成障礙性貧血基因篩查，還能發(fā)現(xiàn)較為罕見的新基因型[19]。徐湘民教授團(tuán)隊(duì)在《EBio Medicine》上報(bào)道我國南方5省2萬人群的珠蛋白生成障礙性貧血基因聯(lián)合篩查結(jié)果，結(jié)果表明基于NGS的珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)能發(fā)現(xiàn)更多的致病或疑似致病變異，其中12.1%的變異為傳統(tǒng)珠蛋白生成障礙性貧血檢測(cè)方式無法檢測(cè)到[20]。本研究針對(duì)可疑假陰性標(biāo)本進(jìn)行DNA序列分析，通過測(cè)序檢出2例以--THAI/αα罕見基因型，不在常規(guī)試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)，為莆田市首次報(bào)道。福建省泉州和三明地區(qū)也曾檢出過該罕見基因型[21-22]，說明該罕見珠蛋白生成障礙性貧血基因型在福建省內(nèi)相對(duì)多發(fā)。因此，當(dāng)臨床遇到可疑珠蛋白生成障礙性貧血但是常規(guī)檢測(cè)陰性，應(yīng)進(jìn)行罕見珠蛋白生成障礙性貧血基因型檢測(cè)，通過DNA序列分析判斷是否為罕見珠蛋白生成障礙性貧血基因突變型，或存在新發(fā)突變，探索莆田市罕見珠蛋白生成障礙性貧血類型、分布情況及遺傳特點(diǎn)，然后針對(duì)高發(fā)的罕見珠蛋白生成障礙性貧血基因設(shè)計(jì)特異探針，擴(kuò)大莆田市常規(guī)珠蛋白生成障礙性貧血基因的檢測(cè)范圍，提升罕見珠蛋白生成障礙性貧血識(shí)別能力，為罕見珠蛋白生成障礙性貧血基因突變攜帶者提供更完善的診斷方案。

本研究全面探索莆田市珠蛋白生成障礙性貧血突變類型及分布特征，完善珠蛋白生成障礙性貧血基因突變圖譜(含常見珠蛋白生成障礙性貧血基因缺陷、罕見珠蛋白生成障礙性貧血和新發(fā)突變)，為珠蛋白生成障礙性貧血診斷提供最新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，今后將制訂個(gè)性化的珠蛋白生成障礙性貧血篩查診斷方案，降低莆田市珠蛋白生成障礙性貧血的漏篩風(fēng)險(xiǎn)。