林靜 楊潔飛 梁權(quán)輝 李煒煊

氯吡格雷是最常用的噻吩吡啶類抗血小板藥物，但由于部分患者對(duì)抗血小板藥物的反應(yīng)存在差異性，經(jīng)氯吡格雷抗血小板治療后仍未能有效抑制血小板功能，造成血栓事件反復(fù)發(fā)生［1］。目前尚未明確氯吡格雷抵抗的機(jī)制，但多認(rèn)為基因多態(tài)性為其發(fā)生主要原因。CYP2C19是肝臟生物轉(zhuǎn)化第一相反應(yīng)最重要的酶，CYP2C19基因多態(tài)性將影響藥物代謝，亦是藥物遺傳學(xué)研究的最早對(duì)象，在藥物代謝過程中有著較為重要的作用［2］。佛山地區(qū)處于亞熱帶沿海地區(qū)，本地人口組成相對(duì)單一，但由于近年來工業(yè)化進(jìn)程加快，外來人口劇增，導(dǎo)致遺傳群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。基因多態(tài)性的情況在不同地區(qū)的表現(xiàn)并非一致，基因型頻率的出現(xiàn)頻率也不完全相同，因此，針對(duì)本地區(qū)人群CYP2C19基因多態(tài)性的調(diào)查顯得尤為重要?；诖?，本研究對(duì)佛山市第一人民醫(yī)院375例冠心病患者展開研究，旨在探討佛山地區(qū)人群CYP2C19基因多態(tài)性以及氯吡格雷藥效反應(yīng)的影響因素分析，具體信息如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2016年8月至2018年2月在佛山市第一人民醫(yī)院治療的冠心病患者375例納入研究，均自愿參與本研究并簽署知情同意書。375名患者中男255例，女120例；年齡31～83歲，平均年齡（65.89±6.73）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)冠脈造影證實(shí)為冠心病患者；②無血緣關(guān)系的佛山常住人口；③連續(xù)服用氯吡格雷75 mg/d 5天以上者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有肺源性心臟病、繼發(fā)性心肌梗死等其他心臟器質(zhì)性病變患者；②肝腎脾和造血功能異常者。③血小板計(jì)數(shù)＜125×109g/L或＞350×109g/L者［3］。

1.2 設(shè)備和儀器

ABI 9700 PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；Baio e-Hyb全自動(dòng)雜交儀購(gòu)自上海百傲科技有限公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1 CYP2C19基因檢測(cè)

EDTA抗凝管采集受試者外周靜脈血2 mL，操作流程：①提取外周血細(xì)胞基因組DNA。②CYP2C19基因特異引物對(duì)1和引物對(duì)2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。③將帶生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在醛基基片上的CYP2C19基因型檢測(cè)探針進(jìn)行特異性雜交，并通過酶促顯色反應(yīng)，使特異性雜交信號(hào)顯現(xiàn)出顏色。④通過軟件分析生物芯片識(shí)讀儀讀出的圖像，判斷待測(cè)樣本基因型。CYP2C19基因檢測(cè)芯片試劑盒由上海百傲科技有限公司提供，采用的方法是DNA微陣列芯片法。*2 G681A和*3 G636A為人基因組CYP2C19主要基因檢測(cè)位點(diǎn)，等位基因主要是*1，*2，*3型。其中*1型無堿基突變，酶活性正常，*2，*3型發(fā)生堿基突變（681G＞A，636G＞A），無酶活性。3種等位基因形成6種基因型，分為突變純合型（*2/*2、*2/*3、*3/*3）、突變雜合型（*1/*2、*1/*3）和野生型（*1/*1）。不同基因型人群間具有不同的氯吡格雷藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征，其中突變純合型為慢代謝型、突變雜合型為中間代謝型、野生型基因?yàn)榭齑x型［4］。

1.3.2 血小板聚集功能檢測(cè)

采集連續(xù)服藥7天以上者靜脈血2 mL（枸櫞酸鈉抗凝管），操作流程：①取全血45 μL與ADP 5 μL混勻活化5 min。②標(biāo)記IgG管和PAg管，分別加入6 μL CD42b抗體。③待全血活化后，取全血5 μL到IgG管和PAg管中，混勻，室溫避光靜置 15～20 min；④分別加入 450 μL 含 1%多聚甲醛的PBS，混勻，閉蓋置于4℃冰箱10 min后上機(jī)檢測(cè)。使用抗體為美國(guó)BD-Pharmingen公司生產(chǎn)的單抗。血小板聚集＞50%判斷為氯吡格雷抵抗［5］。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

①CYP2C19基因多態(tài)性：統(tǒng)計(jì)冠心病患者中的CYP2C19基因型及基因表型的分布情況；②氯吡格雷反應(yīng)組和氯吡格雷抵抗組基因分布差異。③基本資料：探討氯吡格雷抵抗的危險(xiǎn)因素，分析年齡、性別、糖尿病、高血壓、高膽固醇血癥、纖維蛋白原、血小板計(jì)數(shù)，CYP2C19基因表型等情況，并行Logistic多因素分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)和例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以“±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Logistic行多因素分析；應(yīng)用Hardy-weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)研究對(duì)象是否具有群體代表性，均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CYP2C19基因多態(tài)性

2.1.1 CYP2C19基因型及基因表型分布情況

氯吡格雷抵抗組及氯吡格雷反應(yīng)組分別進(jìn)行Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)，CYP2C19等位基因分布符合遺傳平衡法則，說明樣本具有代表性（P＞0.05）。375名冠心病患者中基因型分布情況：野生型CYP2C19*1/*1所占比例（42.13%）；突變雜合型占45.60%，其中CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3分別占40.27%和5.33%；突變純合型占12.79%，其中 CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3、CYP2C19*3/*3分別為7.47%，4.53%和0.27%，見表1。

表1 佛山地區(qū)人群CYP2C19基因型及基因表型分布Table 1 Distribution of CYP2C19 genotype and gene phenotype in population of Foshan

2.1.2 廣東珠三角地區(qū)人群CYP2C19基因分布頻率的比較

在等位基因方面，佛山與廣東其他地區(qū)CYP2C19等位基因分布統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異（P＞0.05），見表2。

表2 佛山地區(qū)人群CYP2C19基因與廣東其他地區(qū)人群的比較（%）Table 2 Comparison of CYP2C19 gene in Foshan population with other populations in Guangdong（%）

2.2 CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷的抗血小板反應(yīng)

2.2.1 氯吡格雷反應(yīng)組與氯吡格雷抵抗組基因表型和等位基因差異

46例突變純合型中氯吡格雷抵抗19例，氯吡格雷反應(yīng)27例；171例突變雜合型中氯吡格雷抵抗53例，氯吡格雷反應(yīng)118例；158例野生型中氯吡格雷抵抗18例，氯吡格雷反應(yīng)140例。氯吡格雷抵抗組和氯吡格雷反應(yīng)組在基因表型和等位基因頻率分布上有明顯差異（P＜0.05），突變純合型在氯吡格雷抵抗組顯著高于氯吡格雷抵反應(yīng)組（21.11%，9.47%），等位基因（*2，*3）的基因頻率在氯吡格雷抵抗組顯著高于氯吡格雷抵反應(yīng)組（50.56%，30.18%）。見表3。

表3 氯吡格雷反應(yīng)組與氯吡格雷抵抗組基因表型和等位基因差異Table 3 Gene phenotype and allelic difference between clopidogrel reaction group and clopidogrel resistance group

2.2.2 基本資料及Logistic回歸分析

氯吡格雷抵抗組年齡、性別、糖尿病、高血壓、高膽固醇血癥、纖維蛋白原，血小板計(jì)數(shù)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；氯吡格雷抵抗組CYP2C19突變純合型和突變雜合型所占比例高于氯吡格雷反應(yīng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。采用Logistic回歸分析，顯示突變純合型（OR=2.557，95%CI：1.344～4.864）和突變雜合型（OR=2.027，95%CI：1.253～3.281）與氯吡格雷抵抗發(fā)生顯著相關(guān)，是氯吡格雷抵抗發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表4 氯吡格雷反應(yīng)組與氯吡格雷抵抗組基本資料對(duì)比Table 4 Comparison of basic data between the clopidogrel reaction group and clopidogrel resistance group

3 討論

細(xì)胞色素P450同工酶也稱藥酶，是由一系列結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的酶組成的超家族，是體內(nèi)藥物代謝的主要酶系［9］。其中，CYP2C19已被多項(xiàng)研究證實(shí)與藥物血藥濃度及酶的抑制和誘導(dǎo)密切相關(guān)［10-11］，成為近年來研究的熱點(diǎn)。CYP2C19基因由于遺傳多態(tài)性，個(gè)體間表現(xiàn)出不同基因型和基因表型。佛山地處亞熱帶沿海地區(qū)，隨著外來人口劇增，導(dǎo)致遺傳群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。因此本文針對(duì)佛山地區(qū)常住人口375名冠心病患者進(jìn)行基因多態(tài)性檢測(cè)，得出CYP2C19基因表型分布情況，以突變雜合型最高（45.60%），其次為野生型（42.13%），突變純合型最低（12.27%）；基因型分布情況以CYP2C19*1/*1（42.13%）所占比例最高，CYP2C19*3/*3（0.27%）所占比例最低；等位基因分布情況，*1、*2、*3分別為64.93%，29.87%，5.2%，其中野生型*1所占比例最高。該基因分布結(jié)果與廣東其它地區(qū)如廣州［6］，深圳［7］，東莞［8］等地區(qū)的基因分布相近。廣東省地處中國(guó)大陸最南部，雖然56個(gè)民族成分齊全，但漢族人口占全省總?cè)丝诘?7.46%，并且廣州，深圳，東莞均是外來人口聚集地。佛山東接廣州，已實(shí)現(xiàn)廣佛同城，人口分布上也基本與廣州同步化，因此由于佛山特殊的地域環(huán)境和人口特征，使得佛山地區(qū)人群CYP2C19基因多態(tài)性分布結(jié)果與廣東其它地區(qū)人群基因分布相近。

一般情況下，臨床需長(zhǎng)時(shí)間服用的藥物副作用較少，但對(duì)于藥物代謝慢的人群，長(zhǎng)期按照正常劑量服用藥物就可能出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作用，導(dǎo)致肝腎損害，甚至可能引起死亡。而作為一種以血紅素為輔基的細(xì)胞色素超家族蛋白酶，CYP2C19參與了氯吡格雷在內(nèi)的大多數(shù)經(jīng)肝代謝的藥物的生物轉(zhuǎn)化過程［12］。氯吡格雷是臨床的一線抗血小板藥物，用于冠心病的Ⅰ、Ⅱ級(jí)預(yù)防，可顯著降低不良心血管事件的發(fā)生率。有研究表明，細(xì)胞色素P450系統(tǒng)中的CYP2C19是氯吡格雷在體內(nèi)代謝的主要代謝酶，其等位基因多態(tài)性與氯吡格雷的抗血小板反應(yīng)多樣性密切相關(guān)［13］。因此，了解不同基因型人群的藥物代謝特征顯得尤為重要。本研究結(jié)果顯示，氯吡格雷抵抗組和氯吡格雷反應(yīng)組在基因表型和等位基因頻率分布上有明顯差異，突變純合型發(fā)生發(fā)生氯吡格雷抵抗的概率遠(yuǎn)高于其它基因表型，這表明不同基因型人群間具有不同的氯吡格雷藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征。突變純合型中CYP2C19*3基因?yàn)榈?外顯子在第636位的突變這導(dǎo)致終止碼提前，產(chǎn)生CYP2C19*3酶，具有較低的代謝功能；CYP2C19*2基因型為CYP2C19基因的第5外顯子在第681位的突變，引起5`端40bp堿基缺失，并對(duì)之后的mRNA閱讀框架造成改變，產(chǎn)生無功能蛋白CYP2C19*2［14］。因此，CYP2C19突變純合型（*2/*2、*2/*3、*3/*3）和突變雜合型（*1/*2、*1/*3）為影響氯吡格雷藥性反應(yīng)的危險(xiǎn)因素，其中突變純合型影響作用更為顯著。上述基因突變將降低氯吡格雷的抗血小板效果，影響藥效反應(yīng)，發(fā)生血栓等嚴(yán)重后果，所以，應(yīng)實(shí)現(xiàn)基因檢測(cè)指導(dǎo)下的個(gè)性化抗血小板治療，比如根據(jù)患者基因檢測(cè)和血小板聚集功能檢測(cè)適當(dāng)增加藥物劑量［15］；對(duì)高?；颊呖蛇x用其它抗血小板藥物或者聯(lián)合用藥；避免同時(shí)接受與氯吡格雷有共同代謝途徑或影響氯吡格雷吸收的藥物，以減少藥物間的相互作用等。

綜上所述，佛山地區(qū)人群CYP2C19基因型與廣東其它地區(qū)人群分布相似，突變純合型和突變雜合型為佛山地區(qū)人群發(fā)生氯吡格雷抵抗的危險(xiǎn)因素，故臨床治療中應(yīng)根據(jù)患者基因檢測(cè)結(jié)果制定個(gè)性化的治療方案，選擇合適的抗血小板治療藥物。