王玲 魏研榮 王麗霞 張艷麗 王晶

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種氣道慢性炎癥性疾病，已成為嚴(yán)重危害人民健康的重要的慢性氣道疾病之一［1］。目前全球約有超過3億哮喘患者，不同國家哮喘總體患病率為1%～8%［2-3］。我國14歲以上人群哮喘患病率為1.24%［4］。由于新疆特殊的地理環(huán)境，以及新疆維吾爾族飲食習(xí)慣、氣候、居住條件等的特殊性，使得新疆成為我國哮喘的高發(fā)地區(qū)之一。研究表明，不同地域、不同民族哮喘的易感基因不同，但大多分布在17號染色體上［5］。全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）表明血清類黏蛋白1樣蛋白3（orosomucoid1-like protein3，ORMDL3）是迄今發(fā)現(xiàn)與兒童哮喘關(guān)聯(lián)證據(jù)最充分的基因［6］。ORMDL3基因s7216389位點單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是哮喘最顯著的相關(guān)標(biāo)記［7］，與香港、南方和內(nèi)蒙古等地區(qū)人群哮喘易感性相關(guān)［8-9］。目前，新疆維吾爾族人群哮喘與ORMDL3基因多態(tài)性的關(guān)系尚未見報道。本研究以烏魯木齊地區(qū)維吾爾族人群為研究對象，探討ORMDL3基因rs7216389、rs12603332位點多態(tài)性與維吾爾族哮喘易感性的關(guān)系，旨在從分子生物學(xué)角度探討哮喘在烏魯木齊地區(qū)維吾爾族人群中的遺傳機制，為臨床診斷及治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2015年1月至2016年12月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院門診及住院確診的維吾爾族哮喘患者（祖籍三代無血緣關(guān)系、無異族通婚史）100例，設(shè)為哮喘組，男27例，女73例，年齡18～70歲，平均年齡（54.3±12.9）歲；收集同期體檢的維吾爾族健康人93例為對照組，男30例，女63例，年齡18～70歲，平均年齡（45.6±17.0）歲。2組在年齡及性別上差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且均來自新疆烏魯木齊地區(qū)。納入標(biāo)準(zhǔn)［4］：（1）典型哮喘的臨床癥狀和體征：①反復(fù)發(fā)作喘息、氣急，伴或不伴胸悶或咳嗽，夜間及晨間多發(fā)，常與接觸變應(yīng)原、冷空氣、物理、化學(xué)性刺激以及上呼吸道感染、運動等有關(guān)；②發(fā)作時雙肺可聞及散在或彌漫性哮鳴音，呼氣相延長；③上述癥狀和體征可經(jīng)治療緩解或自行緩解。（2）可變氣流受限的客觀檢查：①支氣管舒張試驗陽性；②支氣管激發(fā)試驗陽性；③呼氣流量峰值（peak expiratory flow，PEF）平均每日晝夜變異率＞10%或PEF周變異率＞20%。符合上述癥狀和體征，同時具備氣流受限客觀檢查中的任一條，并除外其他疾病所引起的喘息、氣急、胸悶及咳嗽，可診斷為哮喘。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并氣胸、肺癌、肺結(jié)核等其他嚴(yán)重肺部疾病者；②合并嚴(yán)重心腦血管、肝腎和造血系統(tǒng)等原發(fā)性疾病者；③精神病患者；④妊娠及哺乳期婦女；⑤3個月內(nèi)使用全身糖皮質(zhì)激素者；⑥吸煙患者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要儀器

多用電泳儀電源（BG-Power3500，北京百晶生物技術(shù)有限公司），凝膠成像儀（Tanon-3500R，上海天能科技有限公司），PCR儀（EDC-810，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司），紫外分析裝置（FR-110，上海復(fù)日科技有限公司），測序儀（ABI3730XL，美國ABI）等。

1.2.2 主要試劑

HotStar HiFidelity Polymerase Kit（202605，Qiagen 德國），DL2000 DNA Marker（DL2501，上海捷瑞生物工程有限公司），瓊脂糖（AB0013-250g，上海捷瑞生物工程有限公司），溴化乙啶（EB0195-25 g，上海捷瑞生物工程有限公司），F(xiàn)astAP酶（Fermentas，加拿大），外切酶 I（EXO-I）（Fermentas，加拿大），Hi-Di? Formamide（4311320，ABI，美國），SNaPshot?MultiplexKit（4323161，ABI，美國），GeneScanTM-120 GeneScan（4324287，ABI，美國）等。

1.3 研究方法

1.3.1 DNA的提取

采集維吾爾族哮喘患者及健康人空腹靜脈血5 mL，EDTA-Na2抗凝，用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，樣本置-80℃保存。

1.3.2 基因多態(tài)性檢測

使用SNaPshot技術(shù)，毛細管電泳檢測，在美國ABl3730xl型全自動DNA測序儀上進行測序，ORMDL3基因rs7216389、rs12603332位點單核苷酸多態(tài)性的基因分型應(yīng)用GeneMapper 4.1（AppliedBiosystems Co.Ltd.，美國）分析。

1.3.2.1 SNP位點引物設(shè)計 使用Primer Premier 5設(shè)計SNP位點附近上下游引物，rs7216389上游引物序列：CCTGCCTCCAAAACCTAGCA，下游引物序列：GCAGTTCTGTCGCTGTTGTT；rs12603332上游引物序列：GCTGGGCCCG-GATATTTGTA，下游引物序列：AGAGAGAAGAGGCTGGCAGA。

1.3.2.2 DNA樣本質(zhì)檢 DNA樣本取1 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳對其樣本進行質(zhì)檢，用核酸蛋白定量儀測定DNA濃度以及260/280；然后根據(jù)測定的濃度將樣本稀釋到工作濃度5～10 ng/μL。

1.3.2.3 多重PCR反應(yīng) ①多重PCR引物中各引物的終濃度為1 μmol/L；②PCR反應(yīng)體系如下：DNA 1 μL，10×buffer 1.5 μL，MgCL2（25 mmol）1.5 μL，dNTP（10 mmol）0.3 μL，引物（10 μmol）0.15/條，Taq 酶（5 U/μL）0.3 μL，ddH2O 補足到 15 μL；③多重PCR反應(yīng)采用Touch-down的PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性 3 min；（94℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s）-0.5℃/循環(huán)，11 個循環(huán)；94℃ 15 s，54℃15 s，72℃ 30 s，24個循環(huán)；72℃延伸3 min。

1.3.2.4 PCR產(chǎn)物純化 PCR擴增后取3 μL PCR產(chǎn)物用ExoI和FastAP純化，主要是用ExoI去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物，用FastAP去除反應(yīng)中剩余的dNTP。反應(yīng)體系如下：PCR產(chǎn)物3 μL，ExoI（20 U/μL）0.2 μL，F(xiàn)astAP（1 U/μL）0.8 μL，ExoI buffer 0.7 μL，ddH2O 補足到7.0 μL。37℃ 15 min，80℃ 15 min，純化好后進行延伸反應(yīng)，預(yù)先混好延伸引物。

1.3.2.5 SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng) 使用Primer Premier 5設(shè)計SNP位點附近上下游引物進行SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)：①rs7216389延伸引物：TTTTTTGATCAATCAGGGCCGAGTCCATGC，rs12603332延伸引物：TTTTTTTTTACCCAGGGAGCCTTCTCTGACAG；②延伸反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物2 μL，SNaPshot Mix 1 μL，延伸引物（10 μmol）0.2/條，ddH2O 補足到6.0 μL；③PCR循環(huán)程序如下：96℃ 預(yù)變性1 min；（96℃ 10 s，52℃ 5 s，60℃ 30 s），30個循環(huán)。

1.3.2.6 延伸產(chǎn)物測序 上ABI3730XL測序儀測序樣本的制備，體系如下：Hi-Di?Formamide 9.0 μL，純化后的延伸產(chǎn)物1 μL，總體積10.0 μL。將各組分混勻，95℃變性5 min后上ABI3730XL測序儀。

1.3.2.7 原始數(shù)據(jù)分析 ABI3730XL測序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper4.1分析。

1.3.3 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS 17.0軟件進行分析。數(shù)值變量資料均進行正態(tài)性檢驗和獨立樣本t檢驗，分類變量資料組間比較采用χ2檢驗。各研究對象年齡以（±s）表示，基因型頻率及等位基因頻率用百分?jǐn)?shù)表示，各基因型和等位基因頻率的差異性用χ2檢驗，對照組與哮喘組基因型均進行Hardy-Weinberg平衡定律檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 基因組DNA質(zhì)檢電泳圖Figure 1 Genomic DNA quality control electrophoretogram

2 結(jié)果

圖2 rs7216389位點基因分型毛細管電泳峰Figure 2 Allele peaks of rs7216389 genotyped by capillary electmphoresis

圖3 rs12603332位點基因分型毛細管電泳峰Figure 3 Allele peaks of rs12603332 genotyped by capillary electmphoresis

ORMDL3基因 rs7216389、rs12603332位點基因分型結(jié)果，見圖1～圖3，檢測結(jié)果顯示在哮喘組的實際情況中，2個SNP位點中AA、AG和GG基因型分別為61（32.8%）、63（33.9%）和62（33.3%）例，A和G等位基因在該人群中的分布頻率分別為49.8%和50.2%。Hardy-weiberg遺傳平衡檢驗結(jié)果表明數(shù)據(jù)均符合Hardy-weiberg定律（P＞0.05）。由表1可知，與對照組相比，哮喘組ORMDL3基因rs7216389和rs12603332位點的優(yōu)勢等位基因與劣勢等位基因的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 哮喘組與對照組rs7216389和rs12603332位點基因型和等位基因頻率Table 1 The frequencies of genotype and allele of rs7216389 and rs12603332 between the case and the control groups

3 討論

哮喘是一種復(fù)雜的疾病，其發(fā)病涉及到遺傳和環(huán)境因素之間的相互影響，其中遺傳因素占48%～79%不等［10］。哮喘可有明顯的家族聚集性，不同人種、民族、人群在疾病的易感性和抵抗性方面表現(xiàn)出一定的差異［11］。對于哮喘遺傳風(fēng)險因素被證明因不同群體而不同［12］。ORMDL3基因rs7216389位點與兒童哮喘存在較強的關(guān)聯(lián)［13］。劉麗紅等［14］通過 Meta分析發(fā)現(xiàn)，ORMDL3 基因rs7216389多態(tài)性與中國人兒童和成人哮喘發(fā)病均密切相關(guān)。本研究選擇ORMDL3基因rs7216389位點進行多態(tài)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)哮喘組中3種基因型（AA/AG/GG）分別為57.0%、34.4%、8.6%，對不同基因型觀測值和期望值用χ2檢驗檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.092，P＜0.05）。說明ORMDL3基因多態(tài)性是新疆烏魯木齊地區(qū)維吾爾族成人哮喘發(fā)病的危險因素。ORMDL3基因rs12603332位點也是研究與哮喘相關(guān)較多的一個位點。Sabar等［15］發(fā)現(xiàn)rs12603332在巴基斯坦及非裔美洲人群中同哮喘顯著關(guān)聯(lián)。本研究表明ORMDL3基因rs12603332位點與維吾爾族哮喘的發(fā)病水平最為相關(guān)。哮喘組中3種基因型（GG/GA/AA）分別為58.1%、33.3%、8.6%，不同基因型χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.367，P＜0.01）。我們的研究還發(fā)現(xiàn)ORMDL3基因rs12603332位點和rs7216389位點基因型在維吾爾族群體中均符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示我們納入研究的人群具有良好的群體代表性。

觀察哮喘組和對照組ORMDL3基因rs7216389位點基因型發(fā)現(xiàn)，哮喘組AA型純合子明顯高于對照組，表明AA基因型與烏魯木齊維吾爾族哮喘相關(guān)聯(lián)，而哮喘組GG型例數(shù)低于對照組，等位基因A與G的頻率分布在哮喘組頻率分別為74.2%和25.8%，而在對照組為61.5%和38.5%，表明rs7216389位點A等位基因可能是哮喘的危險基因。同樣，哮喘組的ORMDL3基因rs12603332位點GG型純合子高于對照組，而AA型純合子低于對照組，等位基因G與A的頻率分布在哮喘組頻率分別為74.7%和25.3%，而在對照組為58.5%和41.5%，表明rs12603332位點G等位基因可能是哮喘的危險基因，而A等位基因可能是哮喘的保護基因。Wu等［16］對患兒及家長全基因組關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示攜帶優(yōu)勢等位基因的兒童患哮喘風(fēng)險明顯增加，這與我們的研究結(jié)果一致。我們通過對新疆烏魯木齊地區(qū)維吾爾族人群ORMDL3基因rs12603332和rs7216389位點的多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，ORMDL3基因單核苷酸位點多態(tài)性和新疆成人哮喘發(fā)病均密切相關(guān)。但一定條件下地理和環(huán)境因素差異將影響ORMDL3基因表達情況，故本研究還存在不足之處，將來需要擴大樣本量，通過對新疆不同地區(qū)和民族的協(xié)同研究與分析，進一步闡明其在哮喘發(fā)病中的作用，為本地區(qū)哮喘的防治提供有效途徑。

ORMDL3基因的多態(tài)性存在于烏魯木齊地區(qū)維吾爾族人群中，且分布頻率有顯著性。rs7216389位點AA基因型和rs12603332位點的GG基因型可能是哮喘的危險基因型。本研究不僅增加了少數(shù)民族的遺傳資源庫資源，還為今后不同民族該位點與哮喘的致病機制研究提供了遺傳學(xué)依據(jù)。