張曉鑫，王 艷，楊清成

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.安陽(yáng)市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 安陽(yáng) 455001)

急性心肌梗死(acute myocardial infracted，AMI)發(fā)病率較高，且治療難度大，預(yù)后差，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)很大壓力[1]。隨著生物醫(yī)學(xué)模式向“生物-心理-社會(huì)”醫(yī)學(xué)模式的轉(zhuǎn)變，對(duì)AMI患者的治療和預(yù)后產(chǎn)生影響的相關(guān)心理因素逐漸受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。研究顯示，AMI后抑郁是AMI預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且抑郁患者心血管疾病發(fā)病率和病死率高于正常人群[2]。目前，AMI后罹患抑郁癥的機(jī)制尚未明確。有研究顯示，抑郁癥患者和抑郁動(dòng)物模型均存在不同程度的海馬體積萎縮，推測(cè)海馬神經(jīng)元可塑性下降是AMI后罹患抑郁癥的根本原因[3-4]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族，對(duì)發(fā)育中神經(jīng)元的存活、分化以及成體神經(jīng)元的存活和功能起重要作用[5-7]，BDNF下調(diào)通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡和降低神經(jīng)元可塑性而促使海馬神經(jīng)元死亡。本研究以AMI大鼠模型為研究對(duì)象，探討AMI后大鼠探索行為和海馬神經(jīng)元中BDNF表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性成年Sprague-Dawley大鼠25只，購(gòu)自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量(220.0±15.0)g。

1.2主要試劑與儀器兔抗鼠BDNF多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，BDNF抗鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司，山羊抗兔二抗試劑盒、Western blot底物試劑盒、放射免疫沉淀測(cè)定(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，二氨基聯(lián)苯胺(3，3′-diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鼠單克隆抗體、柱式動(dòng)物總RNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex，SABC)試劑盒購(gòu)自上海卡努生物科技有限公司；動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)自北京金新斯盛遠(yuǎn)科技有限公司，心電圖儀購(gòu)自上海欣軟信息科技有限公司，小型垂直電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司，RT-PCR電泳儀購(gòu)自美國(guó)AB公司，凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司，Olympus顯微成像系統(tǒng)購(gòu)自?shī)W林巴斯(中國(guó))有限公司，睡眠剝奪儀購(gòu)自江蘇賽昂斯生物科技有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物分組及AMI模型制備依據(jù)分層抽樣法將大鼠分為對(duì)照組(n=5)和AMI組(n=20)。對(duì)照組大鼠不做任何處理；AMI組大鼠給予0.1 g·L-1水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔內(nèi)注射麻醉，行氣管插管；沿胸部正中依次切開(kāi)皮膚和左側(cè)胸大肌，暴露第3肋間，剪開(kāi)肋間肌，顯露心臟。用眼科縫合線于左冠狀動(dòng)脈左旋支分叉處下方1～2 mm處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎后可見(jiàn)左心室前壁變?yōu)榘导t色，心臟體積變大，心率減慢，即為模型建立成功[8]。依次縫合胸大肌、皮膚，待大鼠恢復(fù)自主呼吸時(shí)撤離呼吸機(jī)；待其蘇醒后腹腔注射青霉素 100 U·kg-1，每日2次，連續(xù)3 d。

1.3.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察各組大鼠探索行為分別于AMI前和AMI后3、7、10、14 d使用大鼠睡眠剝奪儀對(duì)各組大鼠進(jìn)行睡眠剝奪干預(yù)，睡眠剝奪干預(yù)后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)箱為長(zhǎng)80 cm、寬80 cm、高40 cm的木質(zhì)箱，箱內(nèi)背景為黑色，箱底用白線劃分為面積相等的25格。將大鼠置于箱底中央，記錄大鼠 5 min 內(nèi)的行為表現(xiàn)，包括潛伏期(中央格停留時(shí)間)、水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)(水平穿越的格數(shù)，3爪或3爪以上進(jìn)入鄰格的次數(shù))、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)(兩前爪騰空或攀附墻壁的次數(shù))。每測(cè)完1只大鼠要徹底清理箱底，以免遺留糞便氣味影響下1只大鼠的行為。在安靜的房間內(nèi)由2名觀察者進(jìn)行記錄，取均值。

1.3.3蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)AMI后7、14 d各選10只AMI組大鼠，取心臟，AMI后14 d取對(duì)照組5只大鼠心臟。40 g·L-1多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。切片厚度8 μm，60 ℃ 烤箱4 h，常規(guī)脫蠟至水。蘇木精染色3 min，自來(lái)水沖洗，置入0.1 mol·L-1鹽酸乙醇中2 s，自來(lái)水返藍(lán)5 min；伊紅染色2 s，立即取出，自來(lái)水洗2次；常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并照相。

1.3.4鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(streptavidin-biotincomplex，SABC)免疫組織化學(xué)法觀察大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白表達(dá)各組大鼠處死后即刻取大腦，從矢狀縫切開(kāi)左右大腦，1/2大腦組織使用40 g·L-1多聚甲醛固定，1/2大腦組織用于取海馬組織，立即放入液氮罐以備后期提取蛋白質(zhì)和mRNA。多聚甲醛固定大腦組織24 h后沉糖，-80 ℃過(guò)夜；取出后固定至切片托上預(yù)冷2 h，調(diào)切片厚度 20 μm，在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中展片并貼于處理后的載玻片上，選取結(jié)構(gòu)完整的海馬斷面切片，進(jìn)行SABC免疫組織化學(xué)染色，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，顯微鏡下觀察大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白表達(dá)情況。陽(yáng)性神經(jīng)元表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)中均質(zhì)表達(dá)棕褐色顆粒。

1.3.5Westernblot法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白的表達(dá)取2組大鼠海馬組織，液氮冷凍研磨至粉末，移至1.5 mL EP管，加入RIPA裂解液，每1 g海馬組織加入RIPA裂解液10 mL，低溫勻漿器勻漿2 min，4 ℃下3 000 r·min-1離心 5 min，取上清液，二喹啉甲酸法測(cè)蛋白濃度。按15體積比加入相應(yīng)體積的 5×loadding buffer，沸水煮5 min變性。蛋白變性后將其加樣于聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)至PVDF，含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉1 h，分別加兔抗鼠BDNF多克隆抗體(1800稀釋)、GAPDH鼠單克隆抗體(11 000稀釋)一抗孵育，4 ℃過(guò)夜。TBST洗滌后分別加HRP標(biāo)記的山羊抗兔(1500稀釋)、羊抗小鼠二抗(11 000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST洗滌，與增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)。X線膠片曝光顯影。使用Motic Images Advanced3.2軟件進(jìn)行蛋白半定量分析，BDNF蛋白表達(dá)量=BDNF蛋白條帶吸光度值/GAPDH條帶吸光度值。

1.3.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元中BDNFmRNA表達(dá)將各組液氮冷存的海馬組織研磨至粉末狀，采用柱式動(dòng)物總RNA抽提試劑盒提總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備第1鏈cDNA，以第1鏈為模板在反應(yīng)體系中加入目的基因和內(nèi)參基因的引物。BDNF上游引物序列為5′-AGCTGAGCGTGTGT-GACAGTAT-3′，下游引物序列為5′-CTTCCCCTT-TTBTGGTCAGTG-3′；擴(kuò)增片段為331 bp。GAPDH上游引物序列為5′-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3′，下游引物序列為5′-AGGGGCCATCCACAGT-CTTC-3′；擴(kuò)增片段為 595 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。將PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并采用凝膠成像系統(tǒng)照相。采用genetool軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行定量分析，以GAPDH為內(nèi)參照校正，BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量=BDNF條帶的吸光度值/GAPDH條帶的吸光度值[9]。

2 結(jié)果

2.12組大鼠探索行為得分比較結(jié)果見(jiàn)表1。AMI前2組大鼠潛伏期、水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AMI后3、7、10、14 d，AMI組大鼠潛伏期長(zhǎng)于對(duì)照組，水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)少于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表12組大鼠探索行為評(píng)分比較

組別n潛伏期/s水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)對(duì)照組 AMI前50.84±0.1181.20±2.1628.60±2.07 AMI后3 d50.70±0.2080.40±1.1428.82±1.47 AMI后7 d50.83±0.4379.00±2.0029.81±1.09 AMI后10 d50.72±0.2780.20±2.2829.80±1.09 AMI后14 d50.86±0.2179.80±2.6828.60±1.14AMI組 AMI前200.94±0.1979.01±1.2128.71±1.22 AMI后3 d202.04±0.42a73.86±1.97a24.44±1.65a AMI后7 d202.45±0.36a68.87±1.35a19.64±1.52a AMI后10 d102.62±1.18a67.00±2.35a17.00±1.58a AMI后14 d102.47±0.78a60.60±1.52a15.00±1.22a

注：與對(duì)照組比較aP<0.05。

2.22組大鼠心肌組織形態(tài)改變AMI組大鼠冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎后，可見(jiàn)冠狀動(dòng)脈前降支遠(yuǎn)端供血區(qū)心肌組織顏色發(fā)暗，心腔膨脹。在全心切片中可看到梗死區(qū)域左心室前壁變薄，心肌細(xì)胞被纖維組織取代，形成瘢痕。HE染色可見(jiàn)AMI組大鼠心肌梗死區(qū)及梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，且有炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A)；對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞呈粉紅色(圖1B)。

A：AMI組；B：對(duì)照組。

圖12組大鼠心肌組織(HE染色，×100)

Fig.1Myocardialtissuesofratsinthetwogroups(HEstaining，×100)

2.3免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)2組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)照組大鼠海馬組織部分神經(jīng)元呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，分布比較密集。AMI后7、14 d，AMI組大鼠部分海馬神經(jīng)元呈陽(yáng)性表達(dá)，分布較對(duì)照組分散，但AMI后7 d較AMI后14 d分布密集。對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白表達(dá)量為0.45±0.02；AMI后7、14 d，AMI組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白表達(dá)量為0.33±0.08、0.26±0.06；AMI后7、14 d，AMI組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AMI組大鼠AMI后14 d海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白表達(dá)量低于AMI后7 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：對(duì)照組，B：AMI組AMI后7 d；C：AMI組AMI后14 d。

圖22組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF的表達(dá)(SABC法，×100)

Fig.2ExpressionsofBDNFproteininhippocampalneuronofratsinthetwogroups(SABCmethod，×100)

2.4Westernblot法檢測(cè)2組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白表達(dá)量結(jié)果見(jiàn)圖3。對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白表達(dá)量為0.43±0.07，AMI后7、14 d，AMI組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白表達(dá)量分別為0.37±0.05和0.25±0.05；AMI后7、14 d，AMI組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AMI后14 d，AMI組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白表達(dá)量低于AMI后7 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1：對(duì)照組；2：AMI組AMI后7 d；3：AMI組AMI后14 d。

圖32組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白表達(dá)(Westernblot)

Fig.3ExpressionsofBDNFproteininhippocampalneuronofratsinthetwogroups(Westernblot)

2.52組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNFmRNA相對(duì)表達(dá)量比較擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示，在311 bp和595 bp處均有條帶，分別為BDNF和GAPDH，見(jiàn)圖4。對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.221±0.004，AMI后7、14 d，AMI組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.171±0.003和 0.123±0.005；AMI后7、14 d，AMI組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AMI后 14 d，AMI組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量低于AMI后7 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1：對(duì)照組；2：AMI組AMI后7 d；3：AMI組AMI后14 d；4：marker。

圖42組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNFmRNA表達(dá)(RT-PCR)

Fig.4ExpressionsofBDNFmRNAinhippocampalneuronofratsinthetwogroups(RT-PCR)

3 討論

有研究表明，約16%的AMI老年患者在發(fā)病 7 d 內(nèi)即出現(xiàn)抑郁[10]。ROWAN等[11]對(duì)1 302例年 齡>45歲的抑郁患者進(jìn)行了心血管疾病發(fā)病率的前瞻性研究，經(jīng)過(guò) 4 a隨訪發(fā)現(xiàn)，在控制了混雜因素和傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素后，該人群冠狀動(dòng)脈事件 (包括心肌梗死和心源性猝死)發(fā)病率為52%，抑郁對(duì)心血管疾病的相對(duì)危險(xiǎn)度為1.32。曹化等[12]報(bào)道，心血管疾病患者抑郁癥患病率為36.6%，且抑郁行為影響心血管疾病的預(yù)后。REESE等[13]對(duì)222例冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者的跟蹤研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血發(fā)病6個(gè)月后，有抑郁癥狀患者的病死率是無(wú)抑郁癥狀患者的3.5倍。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病并發(fā)抑郁癥患者的預(yù)后較無(wú)抑郁癥患者差，提示抑郁行為影響了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者的預(yù)后。

本研究曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AMI后3、7、10、14 d，AMI組大鼠潛伏期長(zhǎng)于對(duì)照組，水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)少于對(duì)照組；AMI后7、14 d，AMI組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白和mRNA表達(dá)低于對(duì)照組；且AMI后14 d AMI組大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白和mRNA表達(dá)低于AMI后7 d。說(shuō)明心肌梗死單因素刺激能引起大鼠抑郁和海馬神經(jīng)元中BDNF表達(dá)下調(diào)，提示AMI模型大鼠抑郁癥狀的發(fā)病機(jī)制可能與海馬神經(jīng)元中BDNF表達(dá)降低有關(guān)。另外，本研究結(jié)果顯示，不加其他刺激因素的情況下，隨著心肌梗死時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠抑郁行為加重，海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。國(guó)內(nèi)外的臨床調(diào)查研究也顯示了相同的結(jié)果[14-15]。另外，心肌梗死越嚴(yán)重，患抑郁癥的可能性越大[16-17]。周成剛等[18]研究發(fā)現(xiàn)，隨著心功能的惡化，抑郁癥發(fā)病率呈增高趨勢(shì)。有研究表明，心肌梗死患者合并抑郁情緒的概率明顯高于高血壓病患者[19]。另有研究報(bào)道，心肌梗死患者確診3個(gè)月后抑郁癥發(fā)病率高達(dá)44%。

現(xiàn)階段對(duì)于AMI合并抑郁的機(jī)制學(xué)說(shuō)有多種，主要包括：(1)免疫炎癥學(xué)說(shuō)。白細(xì)胞介素-17(interleukin 17，IL-17)是活化CD4淋巴細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，其可促進(jìn)IL-6、IL-8等相關(guān)因子的分泌，同時(shí)上調(diào)細(xì)胞表面的細(xì)胞間黏附因子[20]。王秀華等[21]研究發(fā)現(xiàn)，相比于非抑郁患者，心血管疾病合并抑郁老年患者的血漿IL-17水平顯著增高，說(shuō)明IL-17在心血管疾病后并發(fā)抑郁的發(fā)病機(jī)制中可能起促進(jìn)作用。另外，相關(guān)研究顯示，C反應(yīng)蛋白也參與心血管疾病患者抑郁行為的發(fā)生、發(fā)展[22-23]。(2)心臟自主神經(jīng)功能失調(diào)學(xué)說(shuō)。DRAGO等[24]對(duì)100例AMI患者進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)5 a的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，并發(fā)中、重度抑郁癥患者出現(xiàn)自主神經(jīng)功能失調(diào)，并發(fā)重度抑郁癥患者心率變異性降低，心率增快。PATRON等[25]也得出了相似的結(jié)論。(3)病理生理機(jī)制[26]，即心臟或腦血管硬化影響腦部血液供應(yīng)，造成相應(yīng)部位腦組織缺氧，導(dǎo)致抑郁。無(wú)論是分子免疫學(xué)說(shuō)還是病理生理機(jī)制，前期研究多從血液或心臟方面著手，對(duì)腦組織細(xì)胞因子表達(dá)變化的研究較少。本研究主要觀察了AMI大鼠海馬神經(jīng)元中BDNF蛋白和mRNA表達(dá)的變化，根據(jù)結(jié)果推測(cè)，AMI后抑郁的發(fā)生可能是由于大腦海馬神經(jīng)元供血減少，局部缺氧，BDNF表達(dá)降低，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元非正常死亡，進(jìn)而表現(xiàn)出抑郁樣行為。

綜上所述，大鼠AMI后伴發(fā)抑郁樣行為，其機(jī)制可能與海馬神經(jīng)元中BDNF表達(dá)顯著降低有關(guān)，這為AMI伴發(fā)抑郁患者的治療提供了部分理論依據(jù)。