李雪花，李文媛，李興江，孫廣大，趙庭琪，王 瑩

(1.阜新市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 阜新 123000；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，黑龍江 牡丹江 157011；3.牡丹江醫(yī)學(xué)院神經(jīng)組織工程研究所，黑龍江 牡丹江 157011；4.牡丹江醫(yī)學(xué)院本科2016級，黑龍江 牡丹江 157011)

缺血性腦血管病是危害人類健康的常見疾病，及時恢復(fù)缺血區(qū)的血供是改善其預(yù)后的關(guān)鍵；腦缺血再灌注是其重要的病理生理階段，但較長時間的缺血后再灌注可能進(jìn)一步加劇腦組織損傷和功能障礙，即腦缺血再灌注損傷[1-3]。心臟驟停、休克、卒中、麻醉和術(shù)中體外循環(huán)均可誘發(fā)腦缺血再灌注損傷[4-5]。腦缺血再灌注損傷引起神經(jīng)元損傷的病理生理機(jī)制涉及細(xì)胞凋亡等復(fù)雜細(xì)胞信號通路[6-7]，目前仍不十分清楚，尚缺乏有效的治療方法。深入探討腦缺血再灌注損傷引起神經(jīng)元損傷的機(jī)制有助于改善缺血再灌注損傷的治療策略。Krüpple樣因子7(Krüppel-like factor 7，KLF7)是與神經(jīng)疾病密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，有研究顯示，KLF7參與和調(diào)控神經(jīng)損傷后軸突再生、神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)元分化[8-11]。本課題組前期研究證實(shí)，KLF7在坐骨神經(jīng)和脊髓組織中高表達(dá)顯著促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷和脊髓損傷的功能恢復(fù)，并發(fā)現(xiàn)KLF7能夠促進(jìn)神經(jīng)損傷后感覺神經(jīng)元存活[12-14]。目前，腦缺血再灌注損傷中KLF7對海馬神經(jīng)元的作用及調(diào)控機(jī)制未見報道。本研究通過構(gòu)建氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)大鼠海馬神經(jīng)元體外缺血再灌注損傷細(xì)胞模型，觀察KLF7對OGD/R細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡的影響，旨在探討KLF7在體外對缺血再灌注損傷海馬神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制，為臨床腦缺血再灌注損傷的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物出生24 h內(nèi)新生Sprauge-Dawley(SD)大鼠9只,雌雄不限,體質(zhì)量12～15 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號：SCXK Liao 2003-0009)。

1.2主要試劑與儀器KLF7慢病毒(Lenti-KLF7，美國ABM公司)，KLF7、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine-aspartic acid protease-3,caspase-3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymghoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)的X基因(Bcl-2 associated X protein,Bax)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物(美國Ambion公司)、細(xì)胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK8)、碘化丙啶(propidium iodine,PI)、雙苯并咪唑染料Hoechst33342、胰蛋白酶、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基F12 (Dulbecco′s modified Eagle′s medium F12，DMEM/F12)、胎牛血清(美國Sigma公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、莫洛尼鼠白血病毒反轉(zhuǎn)錄酶(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase，M-MLVRT)、TRIzol(美國Invitrogen公司)；Olympus IX70倒置相差顯微鏡、Olympus AX70免疫熒光顯微鏡(日本Olympus公司),CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本Thermo公司),超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司),C21三氣缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Biospherix公司)，3550UV型酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)。

1.3大鼠海馬神經(jīng)元的分離培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[6]的方法分離新生SD大鼠海馬組織，應(yīng)用胰蛋白酶 37 ℃ 下消化15 min，用含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的DMEM/F12終止消化，制成1×109L-1單細(xì)胞懸液，將單細(xì)胞懸液按每孔1×106個細(xì)胞接種于聚賴氨酸包被6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁繼續(xù)培養(yǎng) 7 d，備用。

1.4大鼠海馬神經(jīng)元OGD/R模型制備參照文獻(xiàn)[15]方法制備大鼠海馬神經(jīng)元OGD/R模型。將培養(yǎng)7 d的原代大鼠海馬神經(jīng)元分為正常組、OGD/R組和OGD/R+ KLF7組，正常組培養(yǎng)7 d的原代大鼠海馬神經(jīng)元按每孔1×106個細(xì)胞于含胎牛血清的DMEM/F12中進(jìn)行培養(yǎng)，置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)3 d。OGD/R組培養(yǎng) 7 d 的原代大鼠海馬神經(jīng)元用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solation，PBS)洗3次，用移液器將原培養(yǎng)液置換為無糖平衡鹽溶液，在三氣缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱(體積分?jǐn)?shù)：1%O2、94%N2、5%CO2)中 37 ℃ 下培養(yǎng)4 h，將細(xì)胞從三氣缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱取出，應(yīng)用4.5 g·L-1葡萄糖培養(yǎng)基代替無糖平衡鹽溶液，置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的常溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。OGD/R+KLF7組取上述培養(yǎng)成功的OGD/R模型細(xì)胞，每孔在原培養(yǎng)液中加入2 μL的Lenti-KLF7慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃下孵育3 d。應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察各組海馬神經(jīng)元的生長狀態(tài)。

1.5實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)檢測各組細(xì)胞中KLF7、NGF、Caspase-3、Bax和Bcl-2mRNA的表達(dá)將3組細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×106個細(xì)胞，應(yīng)用TRIzol提取液提取各組細(xì)胞總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄cDNA。反應(yīng)體系：10 μL SYBR Green PCR Master Mix，2 μL引物和8 μL cDNA。KLF7上游引物序列為5′-TTTCCTGGC-AGTCATCTGCAC-3′，下游引物序列為5′-GGGTC-TGTTTGTTTGTCAGTCTGTC-3′；NGF上游引物序列為5′-CGGTCTTCCCGCCCTAGCCTG-3′，下游引物序列為5′-ATTTGCACGCCGCTCCTTTGC-3′；Caspase-3上游引物序列為5′-TGGAACAAATGGACCTGT-TGACC-3′，下游引物序列為5′-AGGACTCAAAT-TCTGTTGCCACC-3′；Bcl-2上游引物序列為5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′，下游引物序列為5′-TGCATATTTGTTTGGGGCAGG-3′；Bax上游引物序列為5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′，下游引物序列為5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′；GAPDH上游引物序列為5′-TGGTGGGTATGGG-TCAGAAGGACTC3′，下游引物序列為5′-CATGGCT-GGGGTGTTGAAGGTCTCA-3 ′。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，利用2-△△Ct方法分析各組細(xì)胞KLF7、NGF、Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞活性將3組細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×106個細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK8溶液培養(yǎng)2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞于450 nm處的吸光度值[16]，觀察細(xì)胞活性。

1.7Hoechst33342/PI雙染法檢測各組細(xì)胞凋亡率將3組細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1×106個細(xì)胞，用 1 mL Hoechst33342染色液37 ℃下孵育 30 min，PI室溫孵育15 min[17]，在Olympus AX70免疫熒光顯微鏡下用紫外光激發(fā)，計數(shù)細(xì)胞凋亡率,細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.13組海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)倒置相差顯微鏡下觀察可見，正常組海馬神經(jīng)元突起生長明顯，相互交織呈網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)(圖1A)。OGD/R組海馬神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，突起萎縮，網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)受損(圖1B)。OGD/R+ KLF7組較OGD/R組海馬神經(jīng)元數(shù)量增多，突起數(shù)量增加，網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)受損情況改善(圖1C)。

A：正常組；B：OGD/R組；C：OGD/R+ KLF7組。

圖13組海馬神經(jīng)元形態(tài)(倒置相差顯微鏡，×100)

Fig.1Morphologyofhippocampalneuronsinthethreegroups(invertedphasecontrastmicroscope，×100)

2.23組細(xì)胞中KLF7、NGF、Caspase-3、Bax和Bcl-2mRNA相對表達(dá)量比較結(jié)果見表1。3組細(xì)胞中KLF7、NGF、Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=237.702、24.031、476.505、112.900、89.467，P<0.05)。OGD/R組和OGD/R+KLF7組細(xì)胞中KLF7、NGF、Caspase-3、Bax和Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；OGD/R+KLF7組細(xì)胞中KLF7、NGF和Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量顯著高于OGD/R組，Caspase-3和Bax mRNA相對表達(dá)量顯著低于OGD/R組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表13組細(xì)胞中KLF7、NGF、Caspase-3、Bax和Bcl-2mRNA相對表達(dá)量比較

組別nKLF7 mRNANGF mRNABcl-2 mRNACaspase-3 mRNABax mRNA正常組60.101±0.0450.032±0.0090.086±0.0630.037±0.0180.128±0.097OGD/R組60.338±0.053a0.154±0.037a0.476±0.062a1.388±0.047a2.067±0.120aOGD/R+ KLF7組61.020±0.060ab0.285±0.067ab0.840±0.106ab0.437±0.097ab1.210±0.227ab

注：與正常組比較aP<0.05；與OGD/R組比較bP<0.05。

2.33組細(xì)胞活性比較正常組、OGD/R組、OGD/R+ KLF7組細(xì)胞活性分別為1.080±0.090、0.499±0.049和0.727±0.115，3組細(xì)胞活性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=42.710，P<0.05)。OGD/R組和OGD/R+ KLF7組細(xì)胞活性顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；OGD/R+ KLF7組細(xì)胞活性顯著高于OGD/R組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.43組細(xì)胞凋亡率比較結(jié)果見圖2。正常組、OGD/R組、OGD/R+ KLF7組細(xì)胞凋亡率分別為(40.6±6.3)%、(76.7±4.3)%和(58.5±4.4)%，3組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=36.822，P<0.05)。OGD/R組和OGD/R+ KLF7組細(xì)胞凋亡率顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；OGD/R+ KLF7組細(xì)胞凋亡率顯著低于OGD/R組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A：正常組；B：OGD/R組；C：OGD/R+ KLF7組。

圖23組細(xì)胞凋亡情況(Hoechst33342/PI雙染法，×200)

Fig.2Apoptosisinthethreegroups(Hoechst33342/PIdoublestaining,×200)

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),多種轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)基因信號網(wǎng)絡(luò)在缺血性腦損傷過程中具有調(diào)控作用，能夠顯著促進(jìn)腦卒中動物神經(jīng)血管功能恢復(fù)[18-19]。KLF屬于鋅指家族的轉(zhuǎn)錄因子，由17個成員組成，在細(xì)胞生長、分化、增殖、遷移、凋亡、代謝和炎癥反應(yīng)中具有不同的調(diào)節(jié)功能[20]。研究表明,KLF參與調(diào)控多種人類疾病，包括癌癥、糖尿病、肥胖、心血管疾病和炎癥性疾病等[11]。

KLF家族在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)[8]。目前，KLF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中的表達(dá)對神經(jīng)損傷后神經(jīng)元存活和增殖的作用尚不清楚。有研究表明,KLF能夠調(diào)控視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和皮層神經(jīng)元軸突生長能力，其中KLF4和KLF9能抑制軸突再生[21]，而KLF6和KLF7能促進(jìn)軸突生長[8]。研究表明,KLF11可作為一種過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)調(diào)控因子，通過PPARγ介導(dǎo)發(fā)揮腦血管保護(hù)作用[22]。KLF2可作為一種腦卒中保護(hù)因子，通過調(diào)節(jié)血腦屏障促進(jìn)腦血管功能[20]。而KLF7在17個KLF家族成員中具有獨(dú)特的神經(jīng)再生功能，調(diào)控神經(jīng)損傷后軸突再生及神經(jīng)元發(fā)育、分化和存活[11]。然而，KLF7在調(diào)節(jié)腦血管病發(fā)病機(jī)制中的作用和機(jī)制仍不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn),OGD/R組海馬神經(jīng)元數(shù)量較正常組顯著減少，突起萎縮，網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)受損，說明成功構(gòu)建了OGD/R體外缺血再灌注損傷細(xì)胞模型。而應(yīng)用KLF7慢病毒轉(zhuǎn)染能夠有效增加OGD/R體外缺血再灌注損傷海馬神經(jīng)元數(shù)量和神經(jīng)突起生長，改善網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)形成。另外，本研究結(jié)果顯示,OGD/R+ KLF7組細(xì)胞活性較OGD/R組顯著升高，而細(xì)胞凋亡率較OGD/R組顯著降低，提示KLF7對海馬神經(jīng)元缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，推測KLF7是一種參與調(diào)控OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的轉(zhuǎn)錄因子。

本課題組前期研究顯示,KLF7能通過調(diào)控下游靶基因NGF信號通路，顯著促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷和脊髓損傷的功能恢復(fù)，NGF為KLF7下游靶基因，KLF7表達(dá)與NGF表達(dá)具有顯著正相關(guān)性，KLF7通過調(diào)控NGF表達(dá)而調(diào)控神經(jīng)再生微環(huán)境[14]。本研究發(fā)現(xiàn),與正常組和OGD/R組比較，OGD/R+KLF7組細(xì)胞KLF7和NGF mRNA相對表達(dá)量顯著增高，證實(shí)KLF7慢病毒轉(zhuǎn)染顯著促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)KLF7表達(dá)，上調(diào)NGF表達(dá)，因此，推測KLF7通過調(diào)控NGF對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷發(fā)揮保護(hù)作用。Caspase-3、Bcl-2和Bax是調(diào)控神經(jīng)元凋亡的重要途徑，本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R+KLF7組細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著高于OGD/R組，而Caspase-3和Bax mRNA表達(dá)顯著降低，推測KLF7調(diào)節(jié)腦血管發(fā)病機(jī)制可能與介導(dǎo)NGF信號通路，進(jìn)而調(diào)控Caspase-3、Bcl-2和Bax細(xì)胞凋亡信號通路有關(guān)。

綜上所述，KLF7對OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與介導(dǎo)NGF表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控Caspase-3、Bcl-2和Bax細(xì)胞凋亡信號通路有關(guān)。