劉世博，余 璐，王 輝

(河南省免疫與靶向藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

鞘脂是一類含有鞘氨醇骨架的脂類，主要包括鞘磷脂、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂。研究表明，鞘脂在機(jī)體中發(fā)揮著不可或缺的作用[1-4]。鞘脂存在于所有真核細(xì)胞中，是生物膜結(jié)構(gòu)的重要組成成分[5]，其代謝產(chǎn)物包括神經(jīng)酰胺、鞘氨醇及1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)等。S1P是一種具有生物活性的鞘脂類信號(hào)分子，參與多種生理過(guò)程。S1P作為細(xì)胞內(nèi)的第2信使，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、衰老和程序性死亡等許多重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，同時(shí)介導(dǎo)機(jī)體血管生成和炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)體內(nèi)淋巴細(xì)胞的運(yùn)輸及免疫穩(wěn)態(tài)[6]。

鞘氨醇1磷酸酯裂解酶1(sphingosine 1 phosphate lyase 1，SGPL1)是鞘脂代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，是分解代謝S1P的唯一胞內(nèi)酶，其催化S1P和其他長(zhǎng)鏈堿性磷酸酯(long chain base phosphates，LCBPs)在C2～C3部位斷裂，生成磷酸乙氨醇和十六碳烯醇[7]。SGPL1作為鞘磷脂代謝途徑的最終酶，通過(guò)直接調(diào)控體內(nèi)S1P水平而影響體內(nèi)鞘脂類的代謝穩(wěn)態(tài)。但SGPL1對(duì)其他脂類及脂肪代謝的影響尚不清楚。本研究旨在探究SGPL1對(duì)其他脂類及脂肪代謝的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8只雄性8周齡野生型(wide type，WT)小鼠(WT組)購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，4只SGPL1-/-小鼠(SGPL1-/-組)由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院梁銀明教授饋贈(zèng)。小鼠均飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體級(jí)環(huán)境中。

1.2主要試劑與儀器TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR green熒光染料購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司，總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(trigalloyl glycerol，TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，蘇木精、伊紅染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，引物合成于深圳華大基因科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀購(gòu)自上海賽默飛世爾科技有限公司，組織自動(dòng)脫水機(jī)、恒溫?cái)偪酒瑱C(jī)、石蠟切片機(jī)及顯微鏡均購(gòu)自上海徠卡儀器有限公司。

1.3葡萄糖耐量試驗(yàn)(glucosetolerancetest，GTT)和胰島素耐量試驗(yàn)(insulintolerancetest，ITT)檢測(cè)小鼠對(duì)胰島素的敏感性小鼠禁食12 h，剪尾擠出第1滴血，將第2滴血滴在插入血糖儀的試紙條上，讀出數(shù)值為小鼠的空腹血糖水平(0 min)。然后立即腹腔注射100 g·L-1葡萄糖注射液(2 g·kg-1)，分別于注射后第15、30、60、90、120 min擠出小鼠尾部血液到血糖試紙上，通過(guò)血糖儀讀出血糖水平。ITT、GTT結(jié)束3 d后，小鼠禁食12 h，剪尾擠出第1滴血，將第2滴血滴在插入血糖儀的試紙條上，讀出數(shù)值為小鼠的空腹血糖水平(0 min)，然后腹腔注射胰島素(1.5 U·kg-1)，分別在注射后第15、30、60、90、120 min擠出小鼠尾部血液到血糖試紙上，通過(guò)血糖儀讀出血糖水平。

1.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)小鼠血清TC、TG、LDL、HDL水平ITT結(jié)束后麻醉小鼠，摘除小鼠眼球并取血，置于抗凝EP管中，室溫靜置2 h，3 000 r·min-1離心10 min，取上層血清檢測(cè)TC、TG、HDL、LDL水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.52組小鼠體質(zhì)量及脂肪組織質(zhì)量檢測(cè)2組小鼠每周測(cè)1次體質(zhì)量，共5周。于第6周頸椎脫臼處死小鼠，立即解剖分離皮下脂肪組織(subcutaneous adipose tissue，SAT)和附睪脂肪組織(epididymis adipose tissue，EAT)并稱其質(zhì)量，計(jì)算SAT和EAT與體質(zhì)量的比值。

1.6蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色觀察小鼠脂肪組織形態(tài)學(xué)變化2組小鼠脂肪組織測(cè)質(zhì)量后剪取適量的SAT和EAT放入包埋框，浸泡于40 g·L-1多聚甲醛中24 h，脫水后制成石蠟標(biāo)本并進(jìn)行切片，60 ℃烤片，脫蠟，水化，蘇木精染色3 min，蒸餾水返藍(lán)1 min，伊紅染色30 s，然后脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠脂肪組織中脂肪合成、分解及氧化相關(guān)基因的表達(dá)分別剪取2組小鼠適量EAT用液氮研磨至粉末，加入1 mL TRIzol試劑提取總RNA。取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別加入上下游引物、SYBR green熒光染料、水，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)乙酰輔酶A 羧化酶(acetyl-coA carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1C(sterol regulating element binding protein 1C，SREBP-1C)、羧酸酯酶1(carboxylesterase 1，CES1)、激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL)、脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)、肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1)及過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator activated receptor -γ，PPAR-γ)mRNA表達(dá)水平。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參基因。各目的基因及內(nèi)參基因引物序列：ACC上游引物序列為5′-CTCCCGATTCATAATTGGGTCTG-3′，下游引物序列為5′-TCGACCTTGTTTTACTAGGTGC-3′；FAS上游引物序列為5′-GGACTGGTGATAGCCGGTAT-3′，下游引物序列為5′-TGGGTAATCCATAGAGCCCAG-3′；SREBP-1C上游引物序列為5′-GATGTGCGAACTGGA-CACAG-3′，下游引物序列為5′-CATAGGGGGCGTC-AAACAG-3′；CPT1上游引物序列為5′-CTCCGCC-TGAGCCATGAAG-3′，下游引物序列為5′-CACCAGTGATGATGCCATTCT-3′；CES1上游引物序列為5′-ATGCGCCTCTACCCTCTGATA-3′，下游引物序列為5′-AGCA-AATCTCAAGGAGCCAAG-3′；HSL上游引物序列為5′-CCAGCCTGAGGGCTTACTG-3′，下游引物序列為5′-CTCCATTGACTGTGACATCTCG-3′；LPL上游引物序列為5′-GGGAGTTTGGCTCCAGAGTTT-3′，下游引物序列為5′-TGTGTCTTCAGG-GGTCCTTAG-3′；PPAR-γ上游引物序列為5′-TCGCTGATGCACTGCCTATG-3′，下游引物序列為5′-GAGAGGTCCACAGAGCTGATT-3′；GAPDH上游引物序列為5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物序列為5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，連續(xù)循環(huán)38次；ACC、FAS、SREBP-1C、CES1、HSL、LPL、CPT1、PPAR-γ每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用2-△△Ct法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.12組小鼠體質(zhì)量變化WT組小鼠0～5周體質(zhì)量分別為(20.97±0.37)、(22.36±0.43)、(23.12±0.69)、(24.20±0.87)、(24.01±0.92)、(24.55±0.85)g，SGPL1-/-組小鼠0～5周體質(zhì)量分別為(22.46±0.63)、(23.46±0.83)、(22.80±0.58)、(22.57±0.65)、(22.29±0.52)、(21.56±0.32)g；WT組小鼠體質(zhì)量呈緩慢增加趨勢(shì)，SGPL1-/-組小鼠體質(zhì)量呈逐漸下降趨勢(shì)。

2.22組小鼠血清TC、TG、HDL及LDL水平比較WT組小鼠血清TC、TG 、HDL 、LDL水平分別為(3.18±0.24)、(0.59±0.06)、(1.45±0.49)、(0.25±0.06) mmol·L-1，SGPL1-/-組小鼠血清TC、TG 、HDL 、LDL水平分別為(6.42±0.67)、(2.04±0.18)、(4.98±0.69)(0.13±0.12)mmol·L-1；SGPL1-/-組小鼠血清TC、TG、LDL、HDL水平顯著高于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.070、22.993、14.401、6.152，P<0.05，)。

2.32組小鼠SAT和EAT的形態(tài)學(xué)、質(zhì)量及其與體質(zhì)量的比值比較結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。HE染色結(jié)果顯示，與WT組小鼠比較，SGPL1-/-組小鼠EAT和SAT脂肪細(xì)胞變小，血管增多。SGPL1-/-組小鼠SAT、EAT質(zhì)量及其與體質(zhì)量的比值均顯著低于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：WT組小鼠SAT；B：WT組小鼠EAT；C：SGPL1-/-組小鼠SAT；D：SGPL1-/-組小鼠EAT。

圖12組小鼠脂肪組織形態(tài)學(xué)改變(HE染色，×100)

Fig.1MorphologicalchangesofSATandEATofmiceinthetwogroups(HEstaining，×100)

表12組小鼠SAT和EAT質(zhì)量及其與體質(zhì)量的比值比較

組別nSAT質(zhì)量/g與體質(zhì)量比值/%EAT質(zhì)量/g與體質(zhì)量比值/%WT組80.20±0.020.77±0.030.30±0.061.19±0.25SGPL1-/-組40.05±0.000.22±0.020.16±0.010.71±0.07t17.56027.5335.2414.376P0.0030.0010.0350.048

2.42組小鼠對(duì)胰島素的敏感性比較結(jié)果見(jiàn)表2。GTT、ITT結(jié)果顯示，2組小鼠0、15、30、60、90、120 min時(shí)血糖水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表22組小鼠GTT和ITT結(jié)果比較

組別n血糖/(mmol·L-1)0 min15 min30 min60 min90 min120 minWT組8 GTT5.2±0.218.6±0.3 16.4±0.3 12.3±0.18.8±0.3 7.9±0.3 ITT6.5±0.14.0±0.13.3±0.33.1±0.43.6±0.24.2±0.2SGPL1-/-組4 GTT6.1±0.418.3±0.415.4±0.310.6±0.38.7±0.18.2±0.4 ITT6.6±0.24.1±0.13.6±0.33.0±0.13.6±0.14.3±0.1

2.52組小鼠脂肪合成、分解及氧化相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表3。SGPL1-/-組小鼠脂肪組織中脂肪合成相關(guān)基因FAS、SREBP-1C及脂肪分解相關(guān)基因CES1、HSL、LPL和脂肪酸氧化基因CPT1、脂代謝調(diào)控基因PPAR-γ mRNA表達(dá)均顯著高于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組小鼠脂肪組織中脂肪合成基因ACC mRNA表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表32組小鼠脂肪合成、分解及氧化相關(guān)基因表達(dá)

Tab.3Geneexpressionoflipidsynthesis，decompositionandoxidationofmicebetweenthetwogroups

組別nACCFASSREBP-1CCES1HSLLPLCPT1PPAR-γWT組838.5±18.92.1±0.50.2±0.07.3±2.017.6±4.23.1±0.80.2±0.00.7±0.1SGPL1-/-組473.1±35.827.6±6.40.9±0.238.5±18.9935.0±254.01 439.3±342.54 812.5±1 108.4611.6±88.0t4.2588.7359.2097.4658.4948.8107.72413.955P0.0510.0120.0000.0170.0130.0130.0160.006

3 討論

鞘脂類是近年來(lái)研究熱點(diǎn)之一，越來(lái)越多的研究揭示了鞘脂在機(jī)體中的重要功能。鞘脂是細(xì)胞膜的主要結(jié)構(gòu)成分，調(diào)控著細(xì)胞的多種生理功能。SGPL1作為鞘脂代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，直接調(diào)控S1P水平，進(jìn)而參與機(jī)體多種生理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，SGPL1與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫、代謝及疾病發(fā)生有一定聯(lián)系[8-11]。

血脂異常是代謝性疾病尤其是心血管疾病的危險(xiǎn)因素。血清中高水平LDL及其氧化產(chǎn)物氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)會(huì)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。LDL不僅轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇，同時(shí)也是血清中磷脂、溶血磷脂酸及S1P的轉(zhuǎn)運(yùn)分子[12]。SGPL1作為鞘脂降解途徑的最后一個(gè)酶，調(diào)節(jié)鞘脂中間產(chǎn)物的生成，并影響其他脂類的代謝穩(wěn)態(tài)。BEKTAS等[13]研究表明，相比正常WT小鼠，SGPL1敲除小鼠血清及肝臟中鞘脂中間代謝產(chǎn)物鞘氨醇、二氫鞘氨醇、神經(jīng)酰胺水平升高，同時(shí)非鞘脂代謝途徑的磷脂、TG、二酰甘油及膽固醇水平也升高，這說(shuō)明SGPL1不僅調(diào)節(jié)鞘脂代謝，同時(shí)還影響其他脂類的代謝。本研究結(jié)果顯示，小鼠SGPL1突變后，血清TC、TG、HDL、LDL水平均明顯升高，血清脂類代謝嚴(yán)重紊亂。這與BEKTAS等[13]的研究結(jié)果相似。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，給予SGPL1-/-小鼠正常飲食喂養(yǎng)，小鼠體質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，這與正常小鼠的體質(zhì)量變化趨勢(shì)相反。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，SGPL1-/-小鼠的SAT和EAT均明顯減少，SAT和EAT與體質(zhì)量的比值明顯下降，這些結(jié)果提示SGPL1突變影響了脂肪組織的穩(wěn)態(tài)。由于脂肪組織的穩(wěn)態(tài)對(duì)胰島素敏感性起著關(guān)鍵性作用[14]，因此，本研究檢測(cè)了SGPL1-/-小鼠對(duì)胰島素的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SGPL1-/-小鼠的胰島素耐受與WT小鼠基本一致，表明SGPL1突變后，小鼠胰腺β細(xì)胞對(duì)葡萄糖的敏感性及周圍組織對(duì)胰島素的敏感性并未受到損害。

正常情況下，脂肪的合成與分解維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。FAS和ACC是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶[15]，而SREBP-1C可以靶向調(diào)節(jié)LDL受體、ACC及FAS[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，SGPL1突變后，SGOK1-/-組小鼠脂肪組織中FAS、SREBP-1C mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，ACC mRNA雖有上調(diào)趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相比FAS、SREBP-1C的上調(diào)水平，SGPL1-/-小鼠脂肪組織中脂肪分解相關(guān)基因CES1、HSL、LPL mRNA表達(dá)水平升高更顯著。CES1主要參與體內(nèi)脂肪酸和膽固醇的代謝，脂肪組織中CES1的表達(dá)水平不僅反映機(jī)體脂肪含量，還與TC、TG等代謝指標(biāo)呈正相關(guān)[17-18]。說(shuō)明CES1上調(diào)可能是SGPL1突變小鼠血清脂類代謝紊亂及機(jī)體脂肪含量減少的重要原因。此外，脂肪分解限速酶HSL[19]和脂肪酸氧化關(guān)鍵酶CPT1以及LPL、PPAR-γ在SGPL1突變小鼠脂肪組織中表達(dá)也明顯上調(diào)。有研究指出，LPL的主要作用是水解乳糜微粒、極低密度脂蛋白中的TG，是決定脂肪細(xì)胞大小的重要因素[20]。而本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于WT小鼠，SGPL1-/-小鼠脂肪組織中LPL表達(dá)上調(diào)了近千倍以上，這可能是SGPL1-/-小鼠脂肪組織中脂肪細(xì)胞變小的重要原因之一?？偟膩?lái)說(shuō)，SGPL1突變后脂肪組織中脂肪合成和分解氧化基因表達(dá)均上調(diào)，但脂肪分解基因表達(dá)上調(diào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于脂肪合成相關(guān)基因，表明SGPL1突變后脂肪組織以氧化分解為主。

綜上所述，SGPL1在小鼠的脂類和脂肪代謝中發(fā)揮著重要作用，SGPL1突變會(huì)導(dǎo)致小鼠血清脂類代謝紊亂、脂肪氧化分解作用加強(qiáng)及脂肪含量降低，具有潛在的臨床意義，為治療肥胖提供了全新的研究思路和治療靶點(diǎn)。