李元成，何 新，黃文峰，胡曉梅，張自翔，孟 凡

(贛南醫(yī)學(xué)院1.2016級碩士研究生；2.第一附屬醫(yī)院,江西 贛州 341000)

1 消化道菌群

正常人體的消化道內(nèi)寄居著數(shù)量龐大、種類繁多的微生物，其中大部分為細菌(目前已知有大于1 000種)，細胞總數(shù)高達1014，是人體細胞總數(shù)的10倍,這些細菌共同組成細菌群落，稱為菌群[1]。細菌在腸道內(nèi)相互作用，與宿主免疫系統(tǒng)相互影響[1]。不同的個體之間其消化道菌群的組成不盡相同，同一個體的不同成長時期其消化道菌群的組成也是不同的[2]。

目前人類認識的細菌多達50個門，通過細菌表型特征和16S rDNA測序相結(jié)合的方法，能將其分類到合適的綱、目、科和屬之中。一般認為細菌之間16S rDNA序列相似度大于99%為同屬細菌，相似度大于95%為同種細菌[3]。消化道的細菌主要包括了擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和變形菌門等,其中以厚壁菌門和擬桿菌門占絕對優(yōu)勢(占98%以上)[4]。這些細菌按照其對人體的作用大致分為以下三種類型：①生理性細菌，如雙歧桿菌、乳酸桿菌等，這些細菌一般對人體健康有著積極的作用；②條件致病菌，如腸桿菌、腸球菌等，這些細菌一般無害，但在宿主免疫功能低下、定居部位改變或失調(diào)等特定情況下可以引起感染；③病原菌，如變形桿菌、金黃色葡萄球菌等，這些細菌會危害宿主的健康[5]。

消化道菌群是人體的一個重要的“內(nèi)分泌”器官[6]，其功能主要體現(xiàn)在代謝、營養(yǎng)、免疫等方面[7-9]，包括降解一些宿主自身不能分解、利用的物質(zhì)，如將不能被吸收的糖類碳水化合物降解成短鏈脂肪酸，為宿主提供能量；對蛋白的降解產(chǎn)生多酚類有抗炎、抗氧化和抗衰老的作用，同時也會產(chǎn)生氨、胺類等毒性物質(zhì)；維持腸道菌群間平衡，發(fā)揮抑菌或抗菌作用[10]。更重要的是，腸道菌群還參與了腸道屏障的組成，其可以通過調(diào)節(jié)免疫球蛋白A的產(chǎn)生、黏蛋白的表達等來抑制腸道病原體的入侵及免疫應(yīng)答，維持腸道屏障的穩(wěn)固[11]。

2 細菌檢測方法

由于人體消化道的環(huán)境十分復(fù)雜，僅憑培養(yǎng)手段無法對消化道微生物組進行全面認識[12]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)可以通過選取所有細菌共有的基因片段來進行擴增，從而達到鑒定細菌種類的效果[13-15]。16S rDNA是目前最常用的細菌檢測的靶基因，其由保守區(qū)間和可變區(qū)間組成，保守區(qū)為所有細菌共用，且僅僅針對細菌互補，其它微生物對其擴增并無影響，可以利用這一特點使用qPCR技術(shù)擴增出所有細菌的16S rDNA片段，而可變區(qū)由于其在不同類型的細菌中的特異性，故可通過分析可變區(qū)序列來區(qū)分不同的菌種[16]。

與傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法相比，16S rDNA測序有著耗時短、精準度高、能夠全面的反應(yīng)細菌微生態(tài)組成的特點，且對于傳統(tǒng)方法難以培養(yǎng)和進化關(guān)系密切的細菌有較好的識別度，被認為是細菌分類與鑒定的金標準[17]，它不僅可以對感染細菌的種類做出鑒別，還可以通過擴增序列中特定序列的出現(xiàn)頻次來估計該種細菌的含量，即測定出各種細菌在微生態(tài)中所占的比例[18-19]。但其成本較高，且難以鑒別一些16S rDNA片段相似的細菌(如碳疽和蠟樣芽胞桿菌)[20]，如何克服這一困難將是今后研究的重點。

3 消化道菌群與消化系統(tǒng)疾病的關(guān)系

3.1食管疾病與菌群的關(guān)系有學(xué)者利用微生物培養(yǎng)方法證明正常人的食管是無菌環(huán)境，或僅含“過路”菌。而這些“過路”菌大多是通過口腔吞咽至食管或者從胃內(nèi)反流而來[21]，此后又有研究發(fā)現(xiàn)食管的微生物主要包括革蘭陽性菌和革蘭陰性菌兩大類，前者主要存在于正常人的食管內(nèi)，后者多見于食管炎和Barrett食管患者[22]。此后Ning等[23]分別選取6例正常食管、食管炎和Barrett食管患者，利用16S rDNA測序的方法對標本的菌群進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常食管和食管炎、Barrett食管的菌群構(gòu)成不盡相同，正常的食管菌群主要以變形菌門和厚壁菌門為主，還包括少量的擬桿菌、梭桿菌，而食管炎、Barrett食管患者的食管菌群還含有部分的梭桿菌和TM7，這一研究結(jié)果表明了食管存在微生態(tài)，且正常食管和某些疾病狀態(tài)的食管的微生態(tài)組成是不同的。

有研究表明，食管癌的發(fā)病主要包括胃食管反流病、Barrett食管、食管上皮內(nèi)瘤變、食管癌[24]幾個步驟。胃食管反流導(dǎo)致食管黏膜被破壞，食管上皮細胞暴露在微生物群落中，進而導(dǎo)致了慢性炎癥的形成，而慢性炎癥可能是誘導(dǎo)Barrett食管進展為食管癌的重要原因[25]。因此，食管內(nèi)微生態(tài)的改變可能與食管癌的發(fā)生發(fā)展有重要的聯(lián)系，而食管內(nèi)的細菌多是由口腔吞咽或胃內(nèi)反流而來，我們推測研究口腔內(nèi)細菌微生態(tài)的變化可能對食管癌的預(yù)測診斷有著不可低估的價值。

3.2胃部疾病與菌群的關(guān)系正常生理狀態(tài)下，人胃液的pH值在1.5～2.0之間，屬于強酸環(huán)境，能夠殺死大部分進入胃內(nèi)的細菌，從而維持胃及部分小腸相對無菌的狀態(tài)[26]。然而，通過傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn)人體胃內(nèi)仍可分離出少量細菌，以鏈球菌及奈瑟菌為主，通常含量在103cfu·mL-1(cfu：群落形成單位)以下[27]。Williams等[28]認為，胃內(nèi)細菌數(shù)量與pH值密切相關(guān)，以pH值等于4為界，1天內(nèi)pH值大于4的時間越長，胃內(nèi)細菌增殖越旺盛。Nardone等[29]利用16S rDNA測序的方法研究發(fā)現(xiàn)，不同人群中胃內(nèi)細菌微生態(tài)的組成大致相同，主要包括有厚壁菌、擬桿菌、變形菌、放線菌、梭桿菌等5個細菌門，以及鏈球菌、普雷沃菌、乳酸桿菌、韋榮氏球菌等在內(nèi)的69個細菌屬，其中以厚壁菌門的鏈球菌屬、擬桿菌門普雷沃菌屬占比最高。

眾所周知，幽門螺桿菌(Helicobacter Pylori, Hp)感染在胃內(nèi)疾病(如胃炎、消化性潰瘍、非賁門胃癌、低級別B細胞MALT淋巴瘤等)的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要的角色[30]。幽門螺桿菌的致病機制較復(fù)雜，目前認為與其粘附作用、毒力因子對胃粘膜細胞的直接損傷、促進胃粘膜炎癥和免疫反應(yīng)以及影響胃內(nèi)微生態(tài)的組成等有關(guān)[31]。Dicksved等[32]研究發(fā)現(xiàn)：胃癌患者胃內(nèi)除幽門螺桿菌外，仍有鏈球菌屬、乳酸桿菌屬、韋榮氏球菌屬、普雷沃菌屬、流血桿菌屬和奈瑟菌屬等細菌，與正常人胃內(nèi)微生態(tài)存在差異。而這些細菌中有一些含有硝酸還原酶和亞硝酸還原酶，可以將食物中的硝酸鹽和亞硝酸鹽還原成N-亞硝胺和N-亞硝酰胺，后者具有強致癌性[32]。最近，有研究表明非幽門螺桿菌在胃內(nèi)疾病的發(fā)生發(fā)展中也起到了一定的作用，非幽門螺桿菌(non-helicobacter pylorihelicobacters, NHPH)是一種由動物傳播的革蘭陰性菌，其可通過外膜蛋白粘附于胃粘膜上皮細胞上并長期定植，且難以被人體的免疫反應(yīng)所清除，后誘導(dǎo)胃粘膜上皮細胞的DNA損傷，作為“啟動子”引發(fā)“correa級聯(lián)反應(yīng)”[33]。所以，除幽門螺桿菌外，胃內(nèi)尚有其他一系列細菌可能對胃內(nèi)疾病的發(fā)生發(fā)展起到了一定的作用。

3.3腸道疾病與菌群的關(guān)系正常人體以結(jié)腸內(nèi)細菌含量最多，而小腸中的細菌相對較少，越靠近結(jié)腸的部分,細菌含量逐漸上升，胃與上段小腸以革蘭陽性菌為主，下段小腸開始向革蘭陰性菌轉(zhuǎn)變[34]。腸道中的細菌微生態(tài)也同樣處于平衡狀態(tài)，保障了人體消化、免疫等正常生理功能，一旦這種狀態(tài)被打破，就有可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生[35]。腸道菌群失調(diào)的病因多樣，一般認為可能與藥物、腸道解剖結(jié)構(gòu)異常、腸道動力障礙等原因有關(guān)，Othman等[36]提出，小腸細菌過度生長(small intestinal bacterial overgrowth)可能是導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)的重要原因。小腸細菌過度生長通過內(nèi)鏡下獲取Treizt韌帶下方的小腸液進行細菌培養(yǎng)來診斷，一般認為小腸細菌超過105cfu·mL-1定義胃小腸細菌過度生長，但傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)耗時較長，且有部分細菌難以培養(yǎng)，因此在臨床上有一定的局限性[37]。另外，CO2呼氣試驗、氫呼氣試驗等方法也可用于該病的診斷，但其敏感性與特異性較低[38]。相信，不久的將來，16S rDNA測序或許能夠為診斷該病提供幫助。

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種以腹痛或腹部不適伴有排便習(xí)慣和大便性狀改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的功能性腸病，其病因可能與胃腸道動力異常、內(nèi)臟感覺異常、腦腸軸分泌異常、社會心理因素等有關(guān)[39]。而近期研究發(fā)現(xiàn)，IBS患者的腸道菌群和正常人之間存在差異，Kassinen等[40]通過16S rDNA測序的方法對24例IBS患者和23例健康對照的糞便菌群進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IBS患者糞便中的糞球菌屬、糞芽孢菌屬含量低于對照組，而柯林斯氏菌屬含量要高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。國內(nèi)有學(xué)者進一步研究發(fā)現(xiàn)不同分型的IBS患者的糞便菌群也有差異，腹瀉型IBS患者糞便菌群和IBS總體組患者的菌群變化大致相同，以腸桿菌增加，乳酸桿菌、雙歧桿菌減少為主，而便秘型IBS患者則以擬桿菌增加為主，菌群變化較不明顯[41-42]。并且在臨床上，益生菌制劑對IBS具有一定的療效[43]，而近期，有學(xué)者通過糞便菌群移植的方法治療腹瀉型IBS患者也取得了不錯的效果，但目前糞便菌群移植的不良反應(yīng)(如腹瀉、便秘、感染等)發(fā)生幾率較大，其安全性還需更多的臨床研究證實[44]。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一組病因不明的腸道慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機制可能與免疫、遺傳等因素有關(guān)[45]，近期有研究表明，腸道菌群改變可能是其重要的病因之一。有研究發(fā)現(xiàn)[46]，IBD患者糞便中的細菌豐度及穩(wěn)定性均較正常人下降，國內(nèi)有學(xué)者選取30例潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)患者和30例健康對照的糞便進行16S rDNA測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UC患者組擬桿菌屬的數(shù)量較正常對照明顯增加，而梭桿菌屬、柔嫩梭菌屬、雙歧桿菌屬的數(shù)量減少[47]。Kang等[48]通過對比6例克羅恩病(Crohn's disease，CD)患者和健康對照的糞便細菌組成情況發(fā)現(xiàn)，CD患者組糞便中的腸球菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、酵母菌屬等較對照組升高，而小梭菌數(shù)量降低。雖然現(xiàn)有的研究表明IBD患者存在腸道菌群失調(diào)，但還不能很好的證實IBD的發(fā)病與某種特定菌群變化有關(guān)，相信隨著研究的深入和細菌檢測技術(shù)的發(fā)展，我們對IBD的確切病因?qū)懈用鞔_的認識。

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種常見的消化系統(tǒng)腫瘤，其病因包括飲食、免疫、遺傳、環(huán)境等因素，而近期研究表明腸道菌群失調(diào)介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)可能是CRC發(fā)生的重要病因之一[49]。Nosho等[50]發(fā)現(xiàn)，CRC患者癌組織中的具核梭桿菌顯著增高，而具核梭桿菌產(chǎn)生的的活性氧(ROS)和炎癥因子(如IL-6和TNF)可以加重腸道炎癥，促進腫瘤的發(fā)生。有學(xué)者通過細菌培養(yǎng)和DNA測序兩種方法對CRC患者和健康對照的糞便中菌群進行分析，發(fā)現(xiàn)CRC患者糞便中的大腸埃希菌、酵母菌及腸球菌要顯著高于健康對照組，而雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量則較之有所下降[51]。qPCR結(jié)果提示CRC患者組的擬桿菌和丁酸鹽產(chǎn)生菌(如丁酸梭菌)的數(shù)量顯著低于健康對照組，而丁酸鹽是腸道上皮細胞再生修復(fù)的主要物質(zhì)，能夠預(yù)防結(jié)腸炎癥反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生[51]。Wong等[52]研究表明CRC患者和晚期腺瘤患者糞便中具核梭桿菌、厭氧消化鏈球菌以及微小微單胞菌均顯著高于健康對照組，可以作為細菌標志物來預(yù)測CRC的發(fā)生發(fā)展，且具核梭桿菌是優(yōu)于其他兩個標記的一個關(guān)鍵標記，對糞便中的具核梭桿菌進行定量檢測可以提高糞便免疫化學(xué)檢測法預(yù)測CRC的靈敏度。Flemer等[53]通過研究CRC患者、結(jié)直腸息肉患者與健康對照的口腔拭子、腸粘膜以及糞便菌群，發(fā)現(xiàn)毛螺旋菌的豐度與口腔中CRC相關(guān)病原菌在腸粘膜的定植程度呈負相關(guān)，并對口腔及糞便菌群作為結(jié)直腸癌預(yù)測診斷標志物的可行性進行分析，結(jié)果表明結(jié)合口腔菌群與糞便菌群建立的預(yù)測模型的靈敏性和特異度性均有提升。

4 小 結(jié)

消化道菌群作為人體內(nèi)最為復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，除了維持人體正常的生理功能外，其組成的改變也與消化系統(tǒng)疾病之間存在著密切的關(guān)系。但目前大多數(shù)消化系統(tǒng)疾病的診斷仍需依靠內(nèi)鏡、活檢等侵入性或有創(chuàng)性檢查，通過細菌微生物標志物來診斷疾病的方法運用較少。一方面是因為細菌檢測手段尚不成熟，普通細菌培養(yǎng)耗時長且無法全面分析細菌微生態(tài)的構(gòu)成，基因測序的方法雖然更加快速、準確，但其成本較高，臨床應(yīng)用有一定的局限性；另一方面，我們對細菌與消化系統(tǒng)疾病關(guān)系的認識尚不全面，細菌檢測還不能做為診斷消化道疾病的可靠方法。

目前，大部分消化道菌群與疾病相關(guān)的研究還停留在疾病組與對照組之間細菌微生態(tài)構(gòu)成的對比，對于具體致病機制的研究較少。某些疾病與細菌微生態(tài)構(gòu)成改變之間的關(guān)系也尚未明確，沒有很好地鑒別是菌群的改變導(dǎo)致了疾病的發(fā)生亦或是人體的疾病狀態(tài)伴隨有菌群的構(gòu)成變化。但是，消化系統(tǒng)疾病患者的微生態(tài)存在改變已是不爭的事實，某些特定菌種也可能成為相關(guān)疾病治療的新靶點。接下來，我們擬定探索一種新的使用唾液或食管粘膜組織檢測食管癌的檢查方法，同時將此項技術(shù)應(yīng)用于食管癌高危人群中的篩查中。唾液檢查因其簡便、無創(chuàng)、價廉以及患者易于接受等特點，在篩查食管癌方面將具有廣泛應(yīng)用前景。另外，希望做到對食管癌患者早診早防，降低發(fā)病率和死亡率。這些研究將對改善當?shù)蒯t(yī)療健康服務(wù)水平和造福廣大患者將具有較重大的社會現(xiàn)實意義。相信隨著研究的深入和細菌檢測方法的改進，我們會對消化道菌群與消化系統(tǒng)疾病之間的關(guān)系有更加全面的認識，同時為消化系統(tǒng)疾病的診治提供新的方向。