黃昊哲，張吉星，劉佳，徐云根，孫麗萍

（中國藥科大學藥學院藥物化學教研室 江蘇省藥物分子設計與成藥性優(yōu)化重點實驗室，江蘇 南京210009）

Janus激酶（Janus kinases，JAKs）是一種細胞內的非受體酪氨酸激酶，在許多細胞因子受體介導的信號傳導中起到樞紐作用[1]。JAKs參與的信號通路可由多種細胞因子、生長因子以及受體激活，在生物體中參與多種類型細胞的增殖、分化、凋亡，血管生成以及免疫調節(jié)等重要的生理過程。同時JAKs的失調通常伴隨著各種疾病，故其成為具有吸引力的靶標[2]。截至目前，已經有3個JAKs抑制劑被批準上市，并有多個JAK抑制劑被批準進行臨床試驗，表現出良好的開發(fā)前景[2-3]。本文將對JAKs家族及其抑制劑研究狀況，以及針對的適應證進行概述。

1 Janus激酶家族的生物學研究

1.1 Janus激酶家族及其結構

JAKs家族在哺乳動物體內有4個不同的亞型，分別為：JAK1、JAK2、JAK3和酪氨酸激酶2（tyrosine kinase 2，TYK2）。JAKs存在于細胞質中，常分布在核內體和質膜上。除JAK3主要表達于造血細胞外，其他3種亞型均在成年小鼠組織中普遍表達[4]。

JAKs家族的結構具有高度的同源性，由7個同源結構域（JAK homology domain，JH）組成4個保守結構域：C端的假激酶區(qū)（pseudo-kinase domain，JH2）和激酶區(qū)（kinase domain，JH1），以及N端FERM（Four.1 protein，Ezrin，Radixin，Moesin） 區(qū) 和 SH2結 構 域（srchomology 2 domain）（見圖 1）[5]。其中 JH1區(qū)是能夠活化激酶的催化區(qū)域，該區(qū)域在JAKs家族中高度保守，一旦JAKs與細胞因子結合，JH1中活化環(huán)（activation loop）上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，伴隨著蛋白構象發(fā)生變化，隨之激活蛋白及其下游信號通路[6]；研究表明JH2在JH1功能的調控上發(fā)揮著重要作用，該結構域內的突變常導致JAKs活性異常，進而導致某些疾病的發(fā)生[5]；JH3和JH4組成了SH2結構域，被認為能夠起到穩(wěn)定JAKs構象的作用；JH5～JH7（FERM區(qū)）能與細胞因子受體胞內區(qū)域發(fā)生相互作用，調節(jié) JAKs與受體的結合[7]。

圖 1 Janus激酶結構域Figure 1 Domains structure of Janus kinase

1.2 Janus激酶參與的信號通路

JAKs/信號傳導及轉錄激活因子（signal transducers and activators of transcription，STATs） 信 號 通 路 是JAKs在生物體內介導的最主要的通路，當胞外配體結合在膜表面的細胞因子受體上時，該通路啟動。此時2個JAKs分子靠近細胞因子受體，導致受體胞質內區(qū)域構象發(fā)生改變，啟動并激活JAKs蛋白，同時JAKs使得受體胞質內區(qū)域發(fā)生磷酸化，在該區(qū)域內給STATs提供停泊位點（docking sites）。激活的STATs蛋白從受體上脫離并形成磷酸化二聚體，轉移至細胞核內，結合在特定的DNA序列上發(fā)揮生理功能，調控目標基因的轉錄[8-9]。該通路的激活調控了一系列的生理過程，如造血和細胞代謝等[10]。同時有文獻報道，激活的JAKs也能夠介導其他下游級聯(lián)信號，包括磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，也稱 Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和Ras/Raf/有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase kinase，MEK)/細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）下游信號通路（見圖2）[11]。

1.3 Janus激酶與細胞因子

JAKs介導的信號通路能夠被多種細胞因子、生長因子和激素激活。然而特定的細胞因子只能與特定的受體結合，激活并啟動下游特定的JAKs亞型復合物，在相關的生理活動中發(fā)揮重要作用（見圖3）。如JAK1/3復合物是唯一能夠被含有γ鏈的細胞因子受體激活的JAKs家族復合物[4]，包括白細胞介素（interleukin，IL）-2、4、7、9、15和21等細胞因子，該復合物對淋巴細胞的增殖和體內穩(wěn)態(tài)起到關鍵作用[10]。含有β亞基的Ⅰ型細胞因子和激素類細胞因子能夠刺激JAK2同源二聚化，JAK2是骨髓、紅細胞和血小板生成必不可少的因素[3-4]。干擾素（interferon，IFN）家族可激活JAK1/TYK2復合物[3]。IL-10家族細胞因子和含有糖蛋白130（glycoprotein130，gp130）的細胞因子，介導JAK1/2和TYK2的下游信號通路[4]，如IL-6首先激活JAK1/TYK2復合物，再啟動JAK2/TYK2復合物[10]。

圖 2 Janus激酶參與的信號通路Figure 2 Involvement of Janus kinase in signaling pathway

2 Janus激酶通路與疾病的關系

近年來，JAKs通路與疾病的關系越來越受到關注。過度活躍的JAKs在人類炎癥、自身免疫性疾病和骨髓增殖性疾病中有明確的作用[2,4,12-16]。因此，JAKs抑制劑的開發(fā)日益引起重視。

2.1 類風濕性關節(jié)炎

據報道，多種細胞因子在類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的病理過程中具有關鍵作用，這些細胞因子通過不同途徑激活JAKs/STATs信號通路[13]。因此，JAKs蛋白在RA的病理過程中起到關鍵作用，而靶向抑制JAKs已是目前臨床上用于治療RA的有效手段[14]。

2.2 骨髓增殖性腫瘤

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasms，MPN）是以骨髓中異常造血干細胞增殖為特征的一組慢性病癥，包括骨髓纖維化（myelo fi brosis，MF）、真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV）、原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocytosis，ET）和慢性粒細胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）[15]。異常的JAK2信號在MPN的發(fā)病機制中起關鍵作用。95%的PV患者，以及約50% ～ 60%的MF和ET患者具有JAK2的V617F突變[2,4-5,16]。該突變導致JAK2不依賴細胞因子連續(xù)激活，并活化下游信號通路[2]。

圖 3 細胞因子和生長因子刺激的Janus激酶通路[1]Figure 3 Janus kinase signaling pathway stimulated by cytokine and growth factor

2.3 白血病

據報道，在急性淋巴細胞性白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）患者中發(fā)現了JAK1/3和TYK2的突變[4]；有9%的兒童急性T淋巴細胞白血?。═-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）患者出現了IL-7Rα的插入序列，這導致分子間2個半胱氨酸殘基二硫鍵發(fā)生二聚化，允許JAK1在缺乏JAK3和γ鏈的情況下活化[2]。在187例急性B淋巴細胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）患者中，有20例發(fā)生JAK1、JAK2或JAK3突變[2]。

此外，急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）患者中也檢測到JAK1的突變[5]；同時在臨床試驗中發(fā)現了多名患者被檢測到JAK2-V617F突變[2]。這些發(fā)現意味著特異性靶向JAKs的抑制劑在治療這些疾病中將起到有益作用[5,16]。

2.4 淋巴瘤

淋巴瘤（lymphoma）是由成熟的免疫細胞產生的惡性腫瘤。據報道，32%的自然殺傷細胞/T細胞淋巴瘤患者存在JAK3點突變[4]。55%的原發(fā)性縱隔B細胞淋巴瘤（primary mediastinal B-cell lymphoma，PMBL） 患 者和35%的霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma，HL）患者都含有9p24染色體的擴增，涉及的基因包括JAK2[2]。

2.5 銀屑病

銀屑?。╬soriasis）是一種自身免疫性皮膚病，響應于多種細胞因子，包括腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-17、IL-12和IL-23[17]。其中，IL-23通過JAK信號通路刺激TH17細胞產生細胞因子IL-17，其是銀屑病發(fā)生中另一個重要的致病因子[18]。鑒于銀屑病進程依賴于細胞因子介導的JAKs通路，使用JAKs抑制劑阻斷上游IL-23信號能夠間接導致IL-17減少，從而抑制銀屑病的發(fā)生[18]。

2.6 特應性皮炎

在特應性皮炎（atopic dermatitis）中，一些與變應性疾病相關的細胞因子（如IL-4、IL-5和IL-13）過度表達[17-18]。過度表達的細胞因子激活下游的JAKs蛋白，促進疾病的發(fā)展，因此抑制這些下游的JAKs蛋白能夠起到很好的療效[17]。

3 Janus激酶抑制劑

截至2018年3月，已經有很多JAKs抑制劑用于臨床或處于臨床前研究階段。從臨床試驗藥物以及上市藥物來看，目前針對JAK1/3的抑制劑的主要適應證為RA，而針對JAK2靶點開發(fā)的抑制劑的適應證主要為MF、PV等疾病。以下主要按照化學結構對JAKs抑制劑進行分類。

3.1 吡咯并嘧啶類

吡咯并嘧啶是JAKs抑制劑中最常見的一種結構，母核中吡咯上的-NH-和嘧啶N1能與激酶鉸鏈區(qū)形成關鍵氫鍵。輝瑞公司采用高通量篩選得到先導化合物CP-352，664（1），并通過結構改造得到托法替尼（tofacitinib，2），是首個上市用于治療自身免疫性疾病的JAKs抑制劑[19]。多項臨床研究表明，托法替尼對于不同嚴重程度的RA患者都有效，且與阿達木單抗療效相當，療效優(yōu)于甲氨蝶呤[19]?；谶@些發(fā)現，美國FDA批準將托法替尼用于治療對甲氨蝶呤應答欠佳的RA患者[19]。在開發(fā)初期，托法替尼旨在靶向抑制JAK3的活性（IC50=1 nmol · L-1），但后期研究發(fā)現其幾乎對整個JAKs家族都有活性（對JAK2和JAK1的IC50分別為 20 和 112 nmol · L-1）[20]。同時有臨床試驗報道患者使用托法替尼后出現貧血、血小板減少等癥狀，很可能與JAK2抑制有關。

魯索利替尼（ruxolitinib，3）是由Incyte公司開發(fā)的JAK1/2選擇性口服抑制劑，用于治療MF和PV。魯索利替尼在體外對JAK1和JAK2的IC50分別為（3.3±1.2）和（2.8±1.2） nmol · L-1，對 JAK1/2 的 IC50分別是對TYK2和JAK3的6倍和100倍[21]，并能夠顯著延長JAK2-V617F陽性MPN模型小鼠的存活期[21]。臨床試驗表明：在減少高危MF患者的脾腫大和其他相關癥狀方面，魯索利替尼具有顯著且持久的療效[22]，并且在那些未攜帶JAK2-V617F突變的患者中也表現出良好的療效[23]。

巴瑞克替尼（baricitinib，4）是一種強效的JAK1/2選擇性抑制劑（對JAK1和JAK2的IC50分別為5.9和5.7 nmol · L-1），對JAK3和TYK2有優(yōu)異的選擇性（JAK3：IC50＞ 400 nmol · L-1；TYK2：IC50=53 nmol · L-1）[24]。2017年，該產品在日本被批準用于治療中度至重度RA。巴瑞克替尼對RA的療效在Ⅲ期臨床試驗中得到證實[24-25]，對難治性侵襲性RA患者的關節(jié)損傷有顯著改善，且未出現嚴重副作用[26]。

化合物PF-04965842（5）是JAK1選擇性抑制劑（IC50=29 nmol · L-1）。開發(fā)者以托法替尼為先導化合物，修飾托法替尼尾部3-氨基哌啶為磺酰胺結構?；衔?與JAK1和JAK2的X射線共晶的結果證實了該化合物對JAK1的活性優(yōu)于JAK2[27]。該化合物在生化實驗中對JAK2亞型選擇性良好，在動物實驗中對抗原誘導關節(jié)炎（adjuvant-induced arthritis，AIA）大鼠模型有顯著療效[27]；目前其治療特應性皮炎的Ⅲ期臨床試驗正在進行中。

3.2 氨基嘧啶類

Pacritinib（SB1518，6）對Fms樣酪氨酸激酶3（Fms-like tyrosine kinase，FLT3） 和 JAK2的野生型和突變型都有抑制作用（FLT3wt/FLT3D835Y：IC50分別為22 和 6 nmol · L-1；JAK2wt/JAK2V617F：IC50分 別 為 23 和19 nmol · L-1[28]）。化合物6與JAK2的對接顯示：氨基嘧啶與JAK2的ATP結合區(qū)中Leu932作用，連接鏈中氧原子與Ser936形成氫鍵，吡咯烷的堿性氮與Asp939形成鹽橋（見圖4）[29]。Pacritinib顯示了良好的安全性，在原發(fā)性和繼發(fā)性MF患者的臨床研究中具有良好的療效，為MF患者提供了潛在的治療選擇[30-31]。

Momelotinib（CYT387，7）是一種口服的JAK1/2選擇性抑制劑（對JAK1和JAK2的IC50分別為11和18 nmol · L-1），吉利德（Gilead）公司正在對其進行Ⅲ期臨床試驗，用于治療PV、MF和ET。細胞實驗表明：momelotinib能抑制由細胞因子介導的增殖，并阻止JAK2-V617F陽性PV患者的紅細胞集落生長[32]。在小鼠MPN模型中，momelotinib使白細胞計數、血細胞比容和脾臟大小正?；?，并恢復炎性細胞因子至正常生理水平[33]。此外，臨床試驗在評估m(xù)omelotinib的有效性和安全性上，與上市藥物魯索利替尼相比并不遜色[34-35]。

圖 4 化合物6與Janus激酶2對接模式圖Figure 4 Docking mode of compound 6 and Janus kinase 2

體外試驗表明，JAK2抑制劑NS-018（8）有效地抑制了骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）患者骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNCs） 的 形 成， 其 對 正 常BMMNCs的毒性相對較低[36]。NS-018治療MF的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗正在進行中。臨床研究表明：其最常見的藥物相關不良事件是血小板減少癥、貧血、頭暈和惡心；56%的患者的脾臟大小減少了約50%，且MF相關癥狀得到了改善[37]。

3.3 三元稠雜環(huán)類

Kulagowski等[38]在分子模擬研究中發(fā)現托法替尼處于順勢構象時能量最低，同時托法替尼與JAK1的X射線共晶結構圖也顯示其處于順勢構象?；谝陨辖Y論，作者對托法替尼母核進行環(huán)化，將咪唑引入吡咯并吡啶母核。模擬托法替尼與JAK1結合模式，得到新型咪唑并吡啶并吡咯骨架化合物9。此外，還有文獻報道了化合物10 ～ 12在咪唑C2引入取代基能夠與JAK1的Glu966作用，提升化合物對JAK1的活性和選擇性[39-41]。

Hurley等[42]通過骨架躍遷由咪唑并吡啶并吡咯得到新型母核（化合物13）。共晶結構顯示原母核與新型母核以相同模式結合在JAK1上。母核中吡咯并吡啶能與鉸鏈區(qū)Leu959和Glu957形成氫鍵；腈基伸出鉸鏈區(qū)與氨基酸殘基作用。

Upadacitinib（ABT494，14）是由艾伯維（AbbVie）公司開發(fā)的，以吡咯并吡嗪并吡唑為母核的一種非競爭性JAK3三環(huán)抑制劑，其通過與ATP結合位點外的其他區(qū)域相互作用提高了對JAK1的選擇性，對JAK1、JAK2、JAK3和 TYK2的 IC50分 別 為 43、200、2 300、4 700 nmol · L-1[43]。在細胞特異性評價中，該化合物對JAK1的選擇性分別為對JAK2和JAK3的74和58倍[43-44]。目前正在進行一項Ⅲ期臨床試驗，考察upadacitinib對傳統(tǒng)或生物抗風濕藥物治療無效的中度至重度RA的療效。在其治療RA的Ⅱb期臨床試驗中，對于美國風濕病協(xié)會（ACR）規(guī)定的指標達20%、50%和70%的緩解（即ACR20、 ACR50和ACR70應答）的患者比例而言，治療組高于安慰劑組，并存在顯著的劑量-效應關系（P＜0.001）[45-46]。

3.4 共價抑制劑

PF-06651600（15）是JAKs抑制劑中首個共價抑制劑，其結構中的丙烯酰胺基團能夠特異性與JAK3亞型上的Cys909發(fā)生加成反應形成共價結合，目前正處于Ⅱ期臨床，體內療效良好且清除率低。PF-06651600以托法替尼為先導化合物，移除嘧啶氨基上的甲基，使得N-C鍵旋轉180°促進尾部片段靠近Cys909，并引入邁克爾受體與Cys形成共價作用而得，實現了JAK3亞型特異性，IC50為 33 nmol · L-1[47-48]。

Tan等[49]報道了具有高選擇性JAK3抑制活性的2，4-二取代嘧啶類化合物16和17，其中化合物17對 JAK3 的 IC50低于 0.5 nmol · L-1，在轉染的 Ba/F3 細胞試驗中，化合物對JAK3的選擇性分別為對JAK1、JAK2、TYK2的110、210、110倍。X射線共晶結構圖顯示，化合物16母核氨基嘧啶部分與JAK3鉸鏈區(qū)Leu905形成雙齒氫鍵，丙烯酰胺部分與Cys909形成共價鍵，氯原子與Met902形成氫鍵，右側苯環(huán)與Leu956形成范德華力，另外酰胺能與Arg953羰基形成氫鍵（見圖5）。

圖 5 化合物16與Janus激酶3的X射線共晶結構[49]Figure 5 X-ray cocrystal structure of Janus kinase 3 in complex with compound 16

Kempson等[50]于2017年報道了新型的JAK3共價抑制劑18，作者以可逆的JAK3抑制劑（19）作為先導化合物，化合物19與JAK3對接顯示吡啶和酰胺N能與鉸鏈區(qū)形成2個關鍵氫鍵，尾部苯環(huán)片段伸向特異性Cys909（見圖6）。作者在先導化合物尾部引入丙烯酰胺基團，其能夠與Cys909加成形成共價鍵，得到了最優(yōu)化合物18，酶活性和藥動學參數優(yōu)異（對JAK3的 IC50為 1.3 nmol · L-1）。

3.5 其他

Filgotinib（GLPG0634，20）是 JAK1選擇性抑制劑，在動物關節(jié)炎模型中能夠延緩疾病的進展，與依那西普效果相當，并呈現顯著的劑量依賴[51]。在治療RA的Ⅱb期臨床試驗中，與安慰劑組相比， fi lgotinib作為單一療法在治療活動性RA的體征和癥狀方面表現出顯著性差異，且耐受良好[52]。

Pe fi citinib（21）是Astellas Pharma制藥公司開發(fā)的JAKs抑制劑，其用于治療RA的Ⅲ期臨床試驗正在進行中。與安慰劑相比，ACR20應答率顯示出顯著的統(tǒng)計學差異，且未見有嚴重感染病例的報道[53]。

圖 6 化合物19與Janus 激酶3對接模式圖Figure 6 Docking model of compound 19 and Janus kinase 3

4 總結與展望

目前已證實JAKs在細胞增殖和分化過程中起到了重要的作用，JAKs通路中蛋白活性的改變將導致通路信號傳遞的改變，進而影響細胞功能。已有眾多文獻報道JAKs與人類疾病的關系，包括自身免疫性疾病、惡性腫瘤和血液疾病?；贘AKs家族在人體生理和病理過程中的關鍵作用，選擇性抑制JAKs的某些亞型可以有效治療相關疾病，而抑制其他亞型可能會導致不必要的副作用。例如，在對上市藥物托法替尼的臨床研究中發(fā)現，使用該藥物后會導致某些不良反應，包括感染、結核、腫瘤和肝損傷等，研究表明其對幾乎所有JAKs亞型都有活性，而上述不良反應被認為可能與之相關。與此同時，已有文獻闡明不同的JAKs亞型介導不同的生理活動，而其突變也會導致不同的疾病[5,16]。例如，與其他亞型不同，JAK2作為促紅細胞生成素下游的信號蛋白，其失調會導致嚴重的造血功能紊亂和腫瘤；而消除JAK3的功能將導致嚴重的聯(lián)合免疫缺陷[5,16]。TYK2參與干擾素受體的信號，其缺陷導致各種復雜的臨床表現，其中包括特應性皮炎和對各種病原體的易感性[5, 16, 43]。

因此，藥物開發(fā)人員需要明確JAKs亞型所對應的適應證，在藥物研發(fā)過程中避免不必要的不良反應。同時，相信隨著分子生物學對JAKs通路研究的不斷深入，開發(fā)JAKs選擇性抑制劑將取得重大進展，為自身免疫性疾病和腫瘤等疾病的治療提供新的思路。