云南省曲靖市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，云南 曲靖 655000

鱉甲消痔膠囊由地榆、地瓜藤、黃柏、土大黃、鱉甲、槐角、忍冬藤、梔子八味中藥配伍而成，具有清熱解毒、涼血止血、消腫止痛的功效。用于濕熱蘊(yùn)結(jié)所致的內(nèi)痔出血、外痔腫痛、肛周瘙癢。文獻(xiàn)查詢發(fā)現(xiàn)，目前對該制劑的研究主要有：用TLC法對大黃、地榆、槐角、梔子進(jìn)行鑒別；用高效液相色譜法測定制劑中鹽酸小檗堿的含量[1-2]。為了進(jìn)一步研究該制劑，筆者選取該制劑中一種臣藥地榆，建立HPLC法測定地榆中沒食子酸的含量。地榆屬薔薇科植物，采挖后除去須根，洗凈，干燥，或趁鮮切片，干燥。具有涼血止血、解毒斂瘡之功效，用于便血、痔血、血痢、崩漏、癰腫瘡毒等癥。有文獻(xiàn)[3-4]對地榆的抗炎抑菌作用進(jìn)行了研究，研究表明地榆對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草桿菌、變形桿菌，甲型鏈球菌等細(xì)菌具有很好抑制作用。地榆中化學(xué)成分主要為鞣質(zhì)類、三萜皂苷類、黃酮類[5]，其中鞣質(zhì)類化合物是地榆的主要有效成分，沒食子酸是鞣質(zhì)的重要組成成分，也是評價(jià)地榆質(zhì)量的主要指標(biāo)[6]。沒食子酸是自然界中廣泛存在的一種多酚類化合物。有研究表明，沒食子酸具有止血、抗炎、抗突變、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、殺錐蟲等多種生物活性[7-8]。有研究證實(shí)沒食子酸體外對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用[9-10]。本實(shí)驗(yàn)建立高效液相色譜法測定鱉甲消痔膠囊中沒食子酸含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AgiLent1260高效液相色譜儀(配置四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、UV檢測器)；ThermoC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；XS105電子分析天平(梅特勒上海公司)。

1.2 試藥 沒食子酸(90.1%，批號：110831-200803，中國食品藥品檢定研究院)。鱉甲消痔膠囊(批號：1511014、1511038、2576004，貴州漢方藥業(yè)有限公司)。流動(dòng)相用試劑為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：ThermoC18(250×4.6 mm，5 μm；流動(dòng)相：流動(dòng)相0.025%磷酸-甲醇(95.5∶4.5)；流速1.0 mL/min；檢測波長272 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸10.34 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1863 mg/mL沒食子酸儲(chǔ)備液。精密吸取沒食子酸儲(chǔ)備液5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得沒食子酸對照品使用液。

2.2.2 供試品溶液制備 取鱉甲消痔膠囊20粒，精密稱定,混勻，取約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%鹽酸溶液10 mL，振搖，加入30 mL純化水，搖勻，置于電爐上煮沸20 min，取下，冷卻至室溫，過濾，收集濾液置于50 mL容量瓶中。用水洗滌濾渣，合并濾液于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品制備 按處方各藥材比例及制法，制得不含地榆的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取供試品溶液、對照品溶液，按上述色譜條件實(shí)驗(yàn)，對系統(tǒng)適用參數(shù)進(jìn)行考察，沒食子酸理論板數(shù)為6893。理論板數(shù)大于2000[1]。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下的沒食子酸對照品使用液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度；搖勻，即得系列質(zhì)量濃度的對照品溶液。在2.1項(xiàng)下的色譜條件下測定。以沒食子酸濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，經(jīng)線性回歸，回歸方程為Y=17.0217X-3.6469，r=1.0000。結(jié)果表明：沒食子酸在0.9316～46.58 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。對照品、供試品、陰性對照的色譜圖見圖1。

2.5 精密度試驗(yàn) 取同一濃度的對照品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄沒食子酸峰面積，其RSD為0.8%(n=6)。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一在2.2.2項(xiàng)下制備的樣品，在2.1項(xiàng)下色譜條件下分別于2、4、8、16、24 h進(jìn)樣5 μL，記錄峰面積，結(jié)果測得沒食子酸峰面積RSD為0.8%。表明樣品在24 h穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號樣品(批號:2576004)，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下測定，測得沒食子酸含有量RSD為1.2%(n=6)。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的鱉甲消痔膠囊(批號2576004)6份，每份約0.4 g,置具塞錐形瓶中，分別精密加入濃度為0.4209 mg/mL的沒食子酸對照品溶液2.5 mL，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.9 樣品測定結(jié)果 取鱉甲消痔膠囊20粒，精密稱定，混勻，取約0.8 g，精密稱定，平行3份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)下的色譜條件下測定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(mg/粒，n=3)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 取沒食子酸對照品溶液在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，沒食子酸在272 nm處有最大吸收，與中國藥典地榆含量測定項(xiàng)下選用波長一致，故選擇272 nm為檢測波長。

3.2 流動(dòng)相的選擇 首先嘗試了甲醇和水做流動(dòng)相，經(jīng)進(jìn)樣檢測，結(jié)果峰型不好，然后參考中國藥典[1]地榆含量項(xiàng)下流動(dòng)相甲醇-0.05%磷酸溶液(5∶95)，發(fā)現(xiàn)峰型變好，但目標(biāo)峰與相鄰的雜峰分離不是很好，而且雜峰較多，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[11-13]，改變磷酸溶液濃度為0.025%，發(fā)現(xiàn)峰型變好，分離度符合要求，故選擇0.025%磷酸-甲醇(4.5∶95.5)作為流動(dòng)相。

3.3 提取方式的選擇 通過參考中國藥典[1]和文獻(xiàn)[14-15]，嘗試用水和不同濃度(30%、50%、70%)的乙醇作為提取溶劑，煮沸和回流兩種提取方式，提取時(shí)間(10 min、20 min、30 min、40 min)。結(jié)果用水做溶劑通過煮沸含量較高，三種不同濃度乙醇回流含量無明顯差異且比水煮沸含量低。提取時(shí)間20 min、30 min、40 min含量無明顯變化。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)以上幾種提取出的供試品中目標(biāo)峰型較差，而且雜峰多，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[16-17]了解到PH對沒食子酸穩(wěn)定性影響較大，沒食子酸在酸性條件下穩(wěn)定，隨PH值增加穩(wěn)定性逐漸下降，堿性條件下極不穩(wěn)定。嘗試加入不同濃度(2%、5%、10%、15%)的鹽酸溶液。鹽酸溶液加入體積有5、10 mL兩種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入10%鹽酸溶液10 mL,沒食子酸含量測定值最高且與加入15%鹽酸溶液10 mL無明顯差異。綜合以上實(shí)驗(yàn)，確定了本法的提取方式。