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1.貴陽市烏當(dāng)區(qū)新天社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，貴州 貴陽 550000；2. 黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，貴州 都勻 558000

杜仲藥材由杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的新鮮樹皮加工制備而成，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨和安胎的功能，主治肝腎不足引起的腰膝酸軟、筋骨無力，眩暈，妊娠漏血和胎動(dòng)不安等癥狀，我國西南部和長江中上游等地區(qū)為其主產(chǎn)地[1]。文獻(xiàn)資料表明，其所含綠原酸具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、降血壓、調(diào)血脂、抗疲勞、抗氧化、抗炎抗病毒、利膽和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等廣泛的藥理作用[2-3]，是杜仲廣泛生物活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

產(chǎn)地加工是保證藥材質(zhì)量和增強(qiáng)療效的重要技術(shù)手段?！鞍l(fā)汗”作為杜仲的一種特殊加工方法，在歷版《中國藥典》均有記載，其方法的科學(xué)性在以降壓作用或降壓活性成分(松脂醇二葡萄糖苷)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)的研究報(bào)道中得到驗(yàn)證[4-5]。本試驗(yàn)以杜仲綠原酸為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其生品、傳統(tǒng)“發(fā)汗”方法制品和其他“發(fā)汗”方法制品中綠原酸量進(jìn)行測定和比較，以明確基于杜仲綠原酸生物活性的適宜產(chǎn)地加工方法，為指導(dǎo)其產(chǎn)地加工提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260 Infinity II型液相色譜系統(tǒng)(北京安捷倫公司)；AS10200A型超聲波清洗機(jī)(杭州匯爾公司)；DHG-9240A型真空干燥箱(上海金山公司)；METTLER-AE240型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 材料 杜仲新鮮樹皮(樣品編號(hào)：180518)由都勻市小圍寨鎮(zhèn)杜仲種植園提供，生長期均在15年以上，經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系中藥教研室李香副教授鑒定為杜仲科植物EucommiaulmoidesOliv.的樹皮。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：110753-201716，中國食品藥品檢定研究院)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 生品(A1) 將新鮮樹皮刮去粗皮，曬干后密封儲(chǔ)存。

2.1.2 傳統(tǒng)“發(fā)汗”品(A2) 取新鮮樹皮刮去粗皮，將樹皮內(nèi)表面兩兩相對(duì)層層疊放，蓋上稻草，使其“發(fā)汗”，至內(nèi)表面紫褐色時(shí)，取出曬干后密封儲(chǔ)存。

2.1.3 陰至半干后“發(fā)汗”品(A3) 將新鮮樹皮刮去粗皮，于陰涼通風(fēng)處晾至半干后(3 d)，將樹皮內(nèi)表面兩兩相對(duì)層層疊放，蓋上稻草，使其“發(fā)汗”，至內(nèi)表面紫褐色時(shí)，取出曬干后密封儲(chǔ)存。

2.1.4 曬至半干后“發(fā)汗”品(A4) 將新鮮樹皮刮去粗皮，曬至半干后(8 h)，將樹皮內(nèi)表面兩兩相對(duì)層層疊放，蓋上稻草，使其“發(fā)汗”，至內(nèi)表面紫褐色時(shí)，取出曬干后密封儲(chǔ)存。

2.1.5 烘至半干后“發(fā)汗”品(A5) 將新鮮樹皮刮去粗皮，于烘箱中 60℃(2 h)烘至半干后，將樹皮內(nèi)表面兩兩相對(duì)層層疊放，蓋上稻草，使其“發(fā)汗”，至內(nèi)表面紫褐色時(shí)，取出曬干后密封儲(chǔ)存。

2.1.6 煮后“發(fā)汗”品(A6) 將新鮮樹皮刮去粗皮，于沸水中煮 10 min后，撈出，將樹皮內(nèi)表面兩兩相對(duì)層層疊放，蓋上稻草，使其“發(fā)汗”，至內(nèi)表面紫褐色時(shí)，取出曬干后密封儲(chǔ)存。

2.1.7 蒸后“發(fā)汗”品(A7) 將新鮮樹皮刮去粗皮，于籠屜內(nèi)隔水蒸 10 min(按“圓氣”后計(jì))后，取出，將樹皮內(nèi)表面兩兩相對(duì)層層疊放，蓋上稻草，使其“發(fā)汗”，至內(nèi)表面紫褐色時(shí)，取出曬干后密封儲(chǔ)存。

2.2 綠原酸的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相甲醇-1%醋酸水溶液(17：83)；檢測波長：237 nm；柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。色譜圖見圖 1。

2.2.2 供試品溶液的制備[6]取各樣品杜仲藥材約 3 g，剪成碎片后揉成絮狀，精密稱取 1 g置具塞錐形瓶中，加入20%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取60 min后放冷至室溫，用 20%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。按上操作，各樣品均制備3份供試品溶液，冷藏備用。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品一定量，加流動(dòng)相定容至 10 mL容量瓶，搖勻后即得 0.995 mg· mL-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密移取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液不同體積分?jǐn)?shù)，按“2.2.1”色譜條件測定，以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y= 44.931 0X+ 6.306 7，r= 0.999 9。綠原酸在 0.995 ～ 19.9 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 方法學(xué)考察 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法，連續(xù)測定 6次吸光度，峰面積的RSD值為1.63%，說明測量儀器的精密度較高。取標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法，分別在0、0.5、1、1.5、2、3 h測定吸光度，峰面積的RSD值為 3.58%，說明綠原酸在 3 h內(nèi)測定的穩(wěn)定性良好。取 A2樣品 5份，按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，取供試品溶液 10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測定，峰面積的RSD值為 3.06%，說明方法的重現(xiàn)性良好。取已知含綠原酸量的 A2樣品 5份，加入適量標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，取供試品溶液 10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測定，綠原酸平均回收率為 97.67%，RSD值為2.27%，說明該方法的可行性較高。

2.2.6 含量測定 精密移取各樣品提取所得供試品溶液20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法操作并計(jì)算綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表 1。

樣品綠原酸/mg·g-1RSD/% A12. 175 9 ± 0. 038 61. 77 A20. 235 0 ± 0. 008 9**3. 79 A30. 415 6 ± 0. 013 2**++3. 18 A40. 474 8 ± 0. 007 0**++1. 47 A50. 716 7 ± 0. 019 6**++2. 73 A60. 095 9 ± 0. 001 3**++1. 36 A70. 182 3 ± 0. 005 5**++3. 08

注：與A1相比,*P﹤0.05，**P﹤0.01；與A2相比，+P﹤0.05，++P﹤0.01。

2.3 結(jié)果分析

2.3.1 與生品(A1)比較 傳統(tǒng)“發(fā)汗”品(A2)和其他“發(fā)汗”品(A3-A7)對(duì)綠原酸含量的影響均具極顯著性差異(P﹤0.01)，降低明顯，尤以煮后“發(fā)汗”品(A6)和蒸后“發(fā)汗”品(A7)為甚。究其原因，主要與綠原酸的性質(zhì)有關(guān)：一是熱敏性，高溫下綠原酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)極易被破壞，因而煮后“發(fā)汗”品和蒸后“發(fā)汗”品含量極低；二是水解和分子內(nèi)酯基遷移的異構(gòu)現(xiàn)象，“發(fā)汗”加工時(shí)因采用覆蓋物，導(dǎo)致水分氣化速率慢，散失較少，綠原酸發(fā)生水解和分子內(nèi)酯基遷移的異構(gòu)現(xiàn)象可能性增大，因而含量降低。該試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)明，采用“發(fā)汗”加工方法不能提升杜仲生品綠原酸的含量。

2.3.2 與傳統(tǒng)“發(fā)汗”品(A2)比較 其他“發(fā)汗”品(A3-A7)對(duì)綠原酸含量的影響均具極顯著性差異(P﹤0.01)。陰至半干后“發(fā)汗”品(A3)、曬至半干后“發(fā)汗”品(A4)和烘至半干后“發(fā)汗”品(A5)綠原酸含量依次顯著增高；煮后“發(fā)汗”品(A6)和蒸后“發(fā)汗”品(A7)綠原酸含量顯著降低。依次增高的原因是通過采用適當(dāng)干燥方法使“發(fā)汗”藥材部分水分散失，減少了綠原酸發(fā)生水解和分子內(nèi)酯基遷移的異構(gòu)現(xiàn)象可能性，三種方法中以烘至半干后“發(fā)汗”水分散失最快。該試驗(yàn)結(jié)果表明，采用其他“發(fā)汗”加工方法提升傳統(tǒng)“發(fā)汗”加工方法制品中綠原酸含量具有差異化。

3 討論

“發(fā)汗”是杜仲的一種傳統(tǒng)產(chǎn)地加工方法，對(duì)增強(qiáng)杜仲療效和提升質(zhì)量具有重要意義，其科學(xué)性和合理性在杜仲用于降壓的應(yīng)用中得到驗(yàn)證。但杜仲作為一種常用中藥材，生物活性廣泛，產(chǎn)生活性的物質(zhì)基礎(chǔ)眾多，除降壓物質(zhì)木質(zhì)素類(主要是松脂醇二葡萄糖苷)外，亦含環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類、綠原酸類、杜仲膠和抗真菌蛋白等，具有增強(qiáng)免疫力、降血糖、調(diào)血脂、保肝利膽、利尿、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、調(diào)節(jié)骨代謝、補(bǔ)肝護(hù)腎、安胎等生物活性[2]，傳統(tǒng)“發(fā)汗”加工方法對(duì)上述活性物質(zhì)和生物活性的影響如何，是否均能增強(qiáng)其生物活性，目前未見相關(guān)的研究報(bào)道。同時(shí)，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)需“發(fā)汗”加工藥材的方法研究呈現(xiàn)多樣性變化[7-8]，對(duì)提升“發(fā)汗”藥材的療效和質(zhì)量意義重大，而杜仲“發(fā)汗”新方法的研究亦未見。故選用傳統(tǒng)“發(fā)汗”加工方法的杜仲治療除高血壓癥外其他疾病，存在一定科學(xué)性和合理性不足的問題，因而有必要對(duì)其不同活性物質(zhì)開展有針對(duì)性的“發(fā)汗”加工方法研究。

本試驗(yàn)以杜仲的活性成分綠原酸為考察指標(biāo)，測定并比較杜仲生品與不同“發(fā)汗”制品中綠原酸量。結(jié)果表明，杜仲“發(fā)汗”加工制品綠原酸含量均低于生品；其他“發(fā)汗”方法制品與傳統(tǒng)“發(fā)汗”方法制品綠原酸含量有差異化，適宜的“發(fā)汗”方法可提高傳統(tǒng)“發(fā)汗”方法綠原酸的含量。該結(jié)果提示，如從綠原酸的量效關(guān)系角度評(píng)價(jià)，杜仲采用“發(fā)汗”加工方法是不科學(xué)的?？紤]到“發(fā)汗”藥材的目的除提升質(zhì)量和增強(qiáng)療效外，還有利于生物組織內(nèi)部的微生物和功能酶系促發(fā)資源性化學(xué)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化與化學(xué)轉(zhuǎn)化；有利于改善藥材性狀，使之外觀美觀，質(zhì)地致密，香氣味更為濃郁、醇厚；有助于增強(qiáng)或平抑藥材的某一偏性，以達(dá)到改變或緩和藥性的目的等作用，因而杜仲采用“發(fā)汗”加工方法是否具有一定的合理性，仍需不斷的深入研究。綜上所述，如臨床應(yīng)用以杜仲綠原酸的藥理作用為主，就目前《藥典》記載的杜仲加工方法，結(jié)合現(xiàn)有研究的情況，建議不采用“發(fā)汗”加工方法的制品。