陳 祎，張 偉，趙 丹，郭 巍*

(1.北京農(nóng)學院植物科學技術(shù)學院，北京102206；2.河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，河北保定071001)

甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner屬鱗翅目Lepidoptera、夜蛾科Noctuidae，是一種全球性害蟲，寄主繁多，中國20多個省、市、自治區(qū)均有甜菜夜蛾的為害記錄[1]。由于甜菜夜蛾遷飛性驚人，世代重疊嚴重，發(fā)生規(guī)律復(fù)雜，寄主植物種植面積不斷擴大，并且長期以來，單一使用化學藥劑防治、盲目增加藥量，使得該害蟲抗藥性不斷增加，防治效果不理想[2]。如何安全、有效防治甜菜夜蛾是一個亟待解決的問題。幾丁質(zhì)是昆蟲表皮的主要結(jié)構(gòu)成分，參與昆蟲生長發(fā)育的全過程[3]。昆蟲發(fā)育需要經(jīng)歷周期性的蛻皮和形成新表皮的過程，伴隨著幾丁質(zhì)代謝[4]。幾丁質(zhì)脫乙酰酶(chitin deacetylase, CDA)的主要功能是催化幾丁質(zhì)N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺脫去乙?；兂擅撘阴锥≠|(zhì)[5]，是幾丁質(zhì)降解過程中極為重要的一類酶。

自2005年Guo等首次從鱗翅目夜蛾科昆蟲粉蚊夜蛾(Trichoplusiani)中分離出CDA蛋白——TnPM-P42，并驗證其具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性后，研究者相繼從其他昆蟲中克隆得到編碼CDA的基因并研究其重組CDA的催化活性[6]。2008年，Toprak等從蓓帶夜蛾(Mamestraconfigurata)中腸分離得到McCDA1，其原核表達的McCDA1蛋白具有幾丁質(zhì)脫乙酰活性[7]。2012年，Zhong等在畢赤酵母中表達家蠶(Bombyxmori)BmCDA7，測得其幾丁質(zhì)脫乙酰酶活力為1.85 U/mL[8]。2015年，孫曉彤等在畢赤酵母GS115表達甜菜夜蛾SeCDA1，其幾丁質(zhì)脫乙酰酶活力為1.35 U/mL[9]。閆曉平等測得由甲醇誘導(dǎo)在畢赤酵母中表達的美國白蛾(Hyphantriacunea)HcCDA1重組蛋白的酶活力為1.685 U/mL[10]。2017年，趙盼等克隆得到飛蝗(Locustamigratoria)3個幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因，測得由Ni-NTA親和層析柱純化后于Sf9細胞中表達的重組蛋白LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力分別為0.268、0.354和0.228 U/μL[11]。近年來研究表明，幾丁質(zhì)脫乙酰酶可以作為殺蟲靶標，通過干擾幾丁質(zhì)代謝過程來實現(xiàn)對害蟲的防治，具有廣泛的應(yīng)用前景。

本研究對編碼甜菜夜蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶的基因Secda2a進行外源表達，并測定重組蛋白SeCDA2a的酶活力，從分子水平上研究甜菜夜蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶，為明確該酶在甜菜夜蛾幼蟲體內(nèi)的作用機制奠定理論基礎(chǔ)，為研發(fā)新的生防措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試昆蟲和昆蟲細胞培養(yǎng) 甜菜夜蛾為本實驗室人工飼養(yǎng)種群，幼蟲以人工飼料飼養(yǎng)，成蟲喂食10%白糖水。人工氣候箱設(shè)置成以下參數(shù)：溫度(26.5±1)℃，濕度為50%±5%，光照L∶D=14 h∶10 h。草地貪夜蛾細胞系(Sf9)，于27℃人工氣候箱中培養(yǎng)，所用的Grace培養(yǎng)基加入10%的胎牛血清。

1.1.2 主要試劑及菌株 pMD19-T-Secda2a質(zhì)粒(含SacI &NotI酶切位點及目的基因)、pET-28a質(zhì)粒及pFastBac HT A質(zhì)粒由本實驗室保存。限制性內(nèi)切酶、蛋白Marker購自Thermo公司；T4連接酶購自Promega公司；LA Taq酶、DNA Marker、DH5α感受態(tài)細胞購自Takara公司；質(zhì)粒提取試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；BL21(DE3)感受態(tài)細胞、His抗體購自康為試劑公司；DH10Bac感受態(tài)細胞購自北京華越洋生物科技有限公司；Bacmid純化試劑盒及Cellfectin Ⅱ reagent購自Invitrogen公司；胎牛血清購自四季青公司。

1.2 方 法

1.2.1 原核表達載體的構(gòu)建與鑒定 用SacI &NotI酶切pMD19-T-Secda2a質(zhì)粒和pET-28a質(zhì)粒，使用凝膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物。使用T4連接酶將目的基因Secda2a和載體于4℃連接過夜。次日，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21。挑取陽性重組子，提取質(zhì)粒后進行PCR和酶切驗證，驗證正確后送至北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.2 原核表達 將驗證正確的陽性重組子接種于含有卡納霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，次日，向含有卡納霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中接入1%體積的過夜培養(yǎng)的菌液，培養(yǎng)3～3.5 h，至OD600為0.5時，添加誘導(dǎo)物IPTG使其終濃度為0.50 mmol/L，于37℃對其進行誘導(dǎo)表達，并于誘導(dǎo)2、4、6、8 h分別取樣1.5 mL，用于分析SeCDA2a重組蛋白的表達。

1.2.3 引物設(shè)計 使用DNAMAN 7.0軟件分析Secda2a全長序列酶切位點，結(jié)合pFastBac HT A載體上的多克隆位點，設(shè)計基因特異引物，兩端分別添加NcoⅠ &NotⅠ的酶切位點及保護堿基(F： 5′-CATGCCATGGATGGCTCGACACGCGTGTC TGTGTCTT-3′；R：5′-ATTTGCGGCCGCTCA CTTCTTAACATTGAAGCCTTCTCCC-3′)，引物序列中的酶切位點用下劃線標出。

1.2.4 重組Bacmid的構(gòu)建及鑒定 以pMD19-T-Secda2a質(zhì)粒為模板，使用1.2.3中引物PCR擴增獲得Secda2a全長基因，經(jīng)凝膠回收試劑盒純化回收，PCR產(chǎn)物和pFastBac HT A載體分別用NcoⅠ &NotⅠ酶切，酶切產(chǎn)物純化后使用T4連接酶以5∶1的比例連接過夜，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，挑取陽性重組子進行PCR和酶切驗證。鑒定正確后將重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac HT A-Secda2a轉(zhuǎn)化DH10BacTM感受態(tài)細胞，獲得重組桿狀病毒Bacmid-Secda2a。利用通用引物PUC/M13 F&R 進行PCR鑒定。

1.2.5 重組蛋白SeCDA2a在昆蟲細胞Sf9中的表達 選取鑒定正確的重組Bacmid，純化后利用Cellfectin Ⅱ reagent轉(zhuǎn)染昆蟲細胞Sf9，獲得重組病毒P1，繼續(xù)侵染Sf9細胞分別得到P2和P3病毒，收集P3病毒上清得到重組蛋白，具體步驟參照Invitrogen Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)說明書進行。以轉(zhuǎn)染空載體的Sf9細胞培養(yǎng)液上清為對照，進行SDS-PAGE電泳，Western blot分析重組蛋白SeCDA2a的表達。

1.2.6 重組蛋白SeCDA2a酶活力測定 對硝基乙酰苯胺是一種無色晶體，易水解生成黃色針狀結(jié)晶體對硝基苯胺，這種黃色晶體的水溶液在400 nm處有特異性吸光值。參考劉麗萍等的方法繪制對硝基苯胺標準曲線，參考Zhong等的方法用硫酸銨對真核重組蛋白SeCDA2a進行純化作為酶液參與酶促反應(yīng)[8,12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達載體的構(gòu)建與鑒定

目的基因Secda2a與pET-28a載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性重組子，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后，獲得約1.6 kb的目的片段(圖1)。重組質(zhì)粒pET-28a-Secda2a經(jīng)SacI &NotI酶切得到1.6 kb的Secda2a基因片段和5.4 kb的載體片段，與預(yù)期大小一致(圖2)。表明原核表達載體pET-28a-Secda2a構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒PCR鑒定Fig.1 PCR identification of recombinant plasmid

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a-Secda2a酶切鑒定Fig.2 Restriction analysis of of pET-28a-Secda2a

2.2 SeCDA2a重組蛋白的原核表達

用終濃度為0.50 mmol/L IPTG在37℃對重組蛋白進行誘導(dǎo)，分別在誘導(dǎo)2、4、6、8 h取樣，收集菌體沉淀進行檢測。結(jié)果顯示，E.coliBL21成功表達出約61 kDa的目的蛋白，且于4 h之后表達量達到最大(圖3)。

注：0 h是pET-28a-Secda2a未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；2、4、6、8 h是pET-28a-Secda2a經(jīng)IPTG誘導(dǎo)2、4、6、8 h。Note: 0 h represents pET-28a-Secda2a not induced by IPTG; 2, 4, 6, 8 h represent pET-28a-Secda2a induced by IPTG for 2, 4, 6, 8 h.圖3 SDS-PAGE與Western blot檢測IPTG誘導(dǎo)表達的SeCDA2a蛋白Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of SeCDA2a expression induced by IPTG

2.3 重組Bacmid的構(gòu)建及鑒定

以重組質(zhì)粒pMD19-T-Secda2a為模板，利用特異性引物PCR擴增得到約1.6 kb的片段(圖4)。重組質(zhì)粒pFastBac HT A-Secda2a經(jīng)NcoⅠ &NotⅠ酶切驗證正確，表明重組轉(zhuǎn)座載體成功構(gòu)建(圖5)。利用通用引物對重組Bacmid進行PCR驗證，獲得約3.9 kb的目的條帶，表明重組Bacmid-Secda2a構(gòu)建成功(圖6)。

圖4 甜菜夜蛾Secda2aPCR擴增產(chǎn)物Fig.4 PCR amplication product of Secda2a

圖5 重組質(zhì)粒pFastBac HT A-Secda2a酶切鑒定Fig.5 Restriction analysis of pFastBac HT A-Secda2a

2.4 重組蛋白SeCDA2a在昆蟲細胞Sf9中的表達

Bacmid轉(zhuǎn)染生長狀態(tài)良好的Sf9細胞后，獲得原代病毒，傳代培養(yǎng)至第3代，Western blot檢測SeCDA2a在昆蟲細胞中的表達，得到約61 kDa的重組蛋白(圖7)。

圖6 重組Bacmid驗證Fig.6 Dection of recombinant Bacmid

注：CK是未感染重組病毒的Sf9細胞培養(yǎng)液上清；1是感染重組病毒的Sf9細胞培養(yǎng)液上清。Note: 1 represents supernatant of Sf9 cell culture infected by Bacmid; CK represents supernatant of Sf9 cell culture not infected by Bacmid.圖7 重組蛋白SeCDA2a在昆蟲細胞Sf9中的表達Fig.7 Recombinant protein of SeCDA2a expression in Sf9 cells

2.5 重組蛋白SeCDA2a酶活力測定

本研究中對硝基苯胺的標準曲線的線性回歸方程是y=0.1362x+0.0252，R2為0.9988，符合朗伯-比爾定律(圖8)。呈濃度梯度的對硝基苯胺溶液在400 nm處的吸光值具有良好的線性關(guān)系，可以通過分光光度法定量測定對硝基苯胺。本研究測得Sf9細胞表達的重組蛋白SeCDA2a的酶活力是1.57 U/mL。

圖8 對硝基苯胺標準曲線Fig.8 Standard curve of p-nitroaniline

3 討 論

CDA是一種幾丁質(zhì)修飾酶，在昆蟲體內(nèi)的主要功能是脫去表皮幾丁質(zhì)中的乙?；?，生成脫乙酰幾丁質(zhì)，參與昆蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)的代謝[13,14]。該酶可用于擾亂昆蟲正常生長機制，從而達到對害蟲生物防治的目的。

到目前為止，大量昆蟲幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因的功能通過轉(zhuǎn)錄水平分析和RNA干擾技術(shù)得以研究。根據(jù)序列相似度及所含保守區(qū)域多樣性的不同，幾丁質(zhì)脫乙酰酶被分為I-V，共5類。其中，第I類和第Ⅱ類均包含三個保守區(qū)域，幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)、多聚糖乙?；D(zhuǎn)移酶催化區(qū)和低密度脂蛋白結(jié)合區(qū)，第V類僅包含一個多聚糖乙酰基轉(zhuǎn)移酶催化區(qū)[15]。近年來，對昆蟲CDA蛋白的功能研究成果主要集中在兩方面：一方面，第I類CDA蛋白參與調(diào)控昆蟲的蛻皮過程[15-19]，另一方面，第V類CDA蛋白參與中腸免疫[20]。筆者在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上分析SeCDA2a蛋白保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)SeCDA2a包含三個功能域，屬于第I類CDA蛋白，推測其在甜菜夜蛾的蛻皮過程發(fā)揮作用。

體外表達有催化活性的蛋白對于更好研究SeCDA2a的功能意義重大。本課題組孫曉彤在E.coli中表達61.5 kDa的重組蛋白SeCDA1(屬于第I類CDA蛋白)，在畢赤酵母細胞和昆蟲細胞High Five中均表達80 kDa的重組蛋白SeCDA1，并測出兩種真核細胞表達的重組蛋白SeCDA1的酶活力分別為1.88 U/mL和1.35 U/mL[21]。本研究首次在大腸桿菌BL21和昆蟲Sf9細胞中成功表達重組蛋白SeCDA2a，檢測真核重組表達蛋白的幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性；測得酶活力與孫曉彤等[21]、閆曉平等[22]的結(jié)果接近。為了進一步明確SeCDA2a蛋白的功能，仍需從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上對Secda2a基因進行組織定位分析和不同發(fā)育時期表達量分析；利用RNA干擾技術(shù)將Secda2a基因沉默，通過觀察甜菜夜蛾的蛻皮情況，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測基因的沉默率。本研究實現(xiàn)甜菜夜蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因Secda2a的外源表達，測定重組蛋白SeCDA2a的酶活力。