王立嬌，胡勝云，張 雪, 3，陳天慧，于紅欣，周雙海*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2. 房山區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102400；3. 懷柔區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，北京 101400)

以斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征為主的豬圓環(huán)病毒(porine circovirus，PCV)疾病是危害當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的一種重要傳染病，豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是其必需病原[1]。先于PCV2之前發(fā)現(xiàn)的PCV1也存在于一些豬群和傳代細(xì)胞系中[2, 3]，雖然一般認(rèn)為其無明顯致病性，但有研究報道PCV1可能具有潛在致病性或影響疾病的發(fā)展[4, 5]，且其全基因組核苷酸序列在大多數(shù)區(qū)域與PCV2具有高度一致性[6]，故PCV1的存在或污染很可能會干擾PCV2的檢測或研究結(jié)果。建立一種快速鑒別PCV1與PCV2的檢測方法是必要的。

目前，PCR技術(shù)已成為檢測病原的快速、特異、敏感的一種方法。雖然熒光PCR方法在敏感性方面有時高于常規(guī)PCR方法[7, 8]，但其檢測成本較高。與單項PCR檢測方法相比，多重PCR方法在檢測多種病原時可明顯提高檢測效率。本研究旨在建立一種能夠快速鑒別PCV1和PCV2的雙重PCR檢測方法，并初步進(jìn)行臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 病毒模板

PCV1、PCV2、豬細(xì)環(huán)病毒(TTSuV)、偽狂犬病病毒(PRV)等病毒DNA模板由本實驗室保存。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中的PCV1和PCV2核苷酸序列，用primer 5.0軟件設(shè)計2對特異性引物，引物序列分別為1U：5′-CGAAGGCCGATTTGAAGCAGTG-3′、1F：5′-TGCACAGCCCAAAATTATGTGGTAAG-3′和2U：5′-GGTTAGGGCATTGGCCTTT-3′、2F：5′-TCCCGCACCATCGGTTAT-3′，目的片段大小分別為184 bp和264 bp。

1.3 單項PCR方法的擴增產(chǎn)物鑒定及其條件篩選

用2×Taq MasterMix建立25 μL PCR反應(yīng)體系，其中含有1.5 μL的病毒DNA模板、10 pmol上游引物與10 pmol下游引物。PCR反應(yīng)程序為：95℃ 4 min；95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，35 cycles；72℃ 10 min。之后取6 μL PCR擴增產(chǎn)物在20 g/L的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳觀察，并回收純化目的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆與測序，對測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對。同時在此基礎(chǔ)上，篩選單項PCR反應(yīng)的退火溫度和引物濃度以確定最佳單項PCR反應(yīng)條件。

1.4 雙重PCR方法條件篩選

以單項PCR反應(yīng)體系和步驟為基礎(chǔ)，在單項PCR方法條件優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上對雙重PCR反應(yīng)的退火溫度與兩種引物濃度比例進(jìn)行篩選，以確定最佳雙重PCR反應(yīng)條件。

1.5 雙重PCR方法的特異性與敏感性試驗

用TTSuV1、TTSuV2、PRV等常見DNA病毒模板來檢測該雙重PCR方法的特異性。選取5個稀釋度的PCV1 DNA濃度(1.7×105～1.7×101copies/μL)與PCV2 DNA濃度(4.0×105～4.0×101copies/μL)為模板來檢測該雙重PCR方法的敏感性。

1.6 臨床樣品檢測與統(tǒng)計分析

采集2013—2017年京津冀地區(qū)15個豬場145份斷奶仔豬淋巴結(jié)，稱取0.15 g用1 mL滅菌生理鹽水進(jìn)行研磨，凍融3次，12 000 r/min離心7 min，取200 μL上清，按照天根生化科技公司DNA提取試劑盒說明書提取病毒DNA，溶解于50 μL滅菌ddH2O中。用雙重PCR檢測方法和單項PCR檢測方法分別檢測，并隨機選取3個檢測陽性樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定。用卡方檢驗比較兩種方法檢出的PCV1與PCV2的個體陽性率、豬場陽性率之間的差異和PCV1與PCV2的檢出率之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單項PCR產(chǎn)物鑒定及其反應(yīng)條件的優(yōu)化

以PCV1、PCV2的細(xì)胞毒DNA為模板分別進(jìn)行PCR擴增，擴增出約184 bp和264 bp片段大小的目的產(chǎn)物?；厥漳康腜CR產(chǎn)物后進(jìn)行克隆與測序鑒定，BLAST比對結(jié)果顯示目的PCR產(chǎn)物與目標(biāo)基因序列同源性完全一致，證實擴增片段為PCV1或PCV2的目標(biāo)序列。

不同退火溫度進(jìn)行的單項PCR擴增結(jié)果(見圖1)顯示，PCV1和PCV2的目的條帶分別在退火溫度范圍為52～56℃、54～56℃之間較亮，故將二者退火溫度范圍確定為54～56℃。

不同的模板濃度和引物濃度的PCR擴增結(jié)果(見圖2)顯示，PCV1和PCV2的目的條帶都是在其引物濃度為10 μmol/L時最亮、5 μmol/L時次之，故將二者引物濃度范圍確定為5～10 μmol/L。

注：A是PCV1；B是PCV2；M是DNA Marker；1-4是退火溫度分別為50、52、54、56℃；5是陰性對照。Note: A was PCV1；B was PCV2；M was DNA Marker; 1-4 was different annealing temperature (50、52、54、56℃); 5 was negative control.圖1 單項PCR退火溫度的篩選Fig.1 Screening of annealing temperature for the single PCR

注：A是PCV1；B是PCV2；M是DNA Marker；1-3是引物濃度分別為2.5、5、10 μmol/L。Note: A was PCV1；B was PCV2；M was DNA Marker; 1-3 was different concentration of primer (2.5, 5, 10 μmol/L).圖2 單項PCR引物濃度的篩選Fig.2 Screening of primer concentration for the single PCR

2.2 雙重PCR方法條件的優(yōu)化

不同退火溫度與不同引物濃度比例的PCR結(jié)果顯示(見圖3)反應(yīng)，在引物濃度比例固定的情況下，退火溫度為55℃時目的條帶更亮，故確定為最佳退火溫度；在退火溫度固定的情況下，PCV1與PCV2的引物濃度比例為5 μmol/L比5 μmol/L時2條目的條帶都較亮，故確定為最佳引物濃度比例。

注：M是DNA Marker；1-4、5-8、9-12是退火溫度分別為54、55、56℃；1、5、9是PCV1與PCV2的引物濃度比例為5 μmol/L比5 μmol/L；2、6、10是PCV1與PCV2的引物濃度比例為5 μmol/L比10 μmol/L；3、7、11是PCV1與PCV2的引物濃度比例為10 μmol/L比5 μmol/L；4、8、12是PCV1與PCV2的引物濃度比例為10 μmol/L比10 μmol/L；13是陰性對照。Note：M was DNA Marker; 1-4 was annealing temperature of 54℃; 5-8 was annealing temperature of 55℃; 9-12 was annealing temperature of 56℃; 1, 5 and 9 meant that ratio of primer concentration for PCV1 to PCV2 was 5 μmol/L to 5 μmol/L; 2, 6 and 10 meant that ratio of primer concentration for PCV1 to PCV2 was 5 μmol/L to 10 μmol/L; 3, 7, 11 meant that ratio of primer concentration for PCV1 to PCV2 was 10 μmol/L to 5 μmol/L; 4, 8 and 12 meant that ratio of primer concentration for PCV1 to PCV2 was 10 μmol/L to 10 μmol/L; 13 was negative control.圖3 雙重PCR退火溫度與引物濃度的篩選Fig.3 Screening of primer concentration and annealing temperature for the duplex PCR

2.3 雙重PCR方法的特異性與敏感性試驗

特異性試驗結(jié)果(見圖4)顯示，僅含有PCV1、PCV2的DNA模板擴增出特異性目的產(chǎn)物條帶，表明建立的雙重PCR檢測方法具有良好特異性。

敏感性試驗結(jié)果(見圖5)顯示，能夠擴增出PCV1與PCV2的特異目的產(chǎn)物條帶的最低濃度分別為1.7×103、4×103copies/μL，故確定這2個數(shù)值為雙重PCR檢測方法的相應(yīng)靈敏度。

2.4 臨床樣品的檢測與分析

用單項PCR和雙重PCR方法對2013—2017年京津冀地區(qū)15個豬場的斷奶仔豬臨床樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果(見表1)顯示，PCV1的單項PCR與雙重PCR的檢測陽性率分別在0%～37.5%、0%～30.8%之間，其總個體陽性率分別為15.9%、11.7%，二者之間無顯著差異(P>0.05)，符合率為95.9%；并且2種PCR方法檢出的PCV1豬場陽性率都是53.3%。PCV2的單項PCR與雙重PCR的檢測陽性率都在62.5%～100%之間，其總個體陽性率分別為82.8%、77.2%，二者之間無顯著差異(P>0.05)，符合率為94.5%；所檢出的豬場陽性率均為100%。隨機選取3個檢測陽性樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆與測序鑒定，結(jié)果顯示所克隆序列與相應(yīng)參考序列的核苷酸同源率均達(dá)99%以上，證實PCR檢測結(jié)果的確為PCV1或PCV2，說明臨床檢測結(jié)果有很好的特異性。

M：DNA Marker；1：PCV1；2：PCV2；3：PRV；4：TTSuV1；5：TTSuV2圖4 雙重PCR的特異性檢測Fig.4 The specificity of the duplex PCR

注：M是DNA Marker；1-5是PCV1和PCV2的DNA濃度分別為1.7×105～1.7×101 copies/μL、4.0×105～4.0×101 copies/μL；6是陰性對照。Note：M was DNA Marker; 1-5 was DNA concentration of PCV1 (1.7×105～1.7×101 copies/μL) and PCV2 (4.0×105～4.0×101 copies/μL); 6 was negative control.圖5 雙重PCR的敏感性試驗Fig.5 The sensitivity of the duplex PCR

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)(見表1)，PCV2的個體陽性率超過70%而極顯著(P<0.01)高于PCV1的不足20%。同時，PCV2的豬場陽性率為100%，極顯著(P<0.05)高于PCV1的53.3%。

表1 臨床樣品中PCV1與PCV2檢出率的比較Tab.1 Comparison of detection rate of PCV1 and PCV2

注：同列數(shù)據(jù)尾部有不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Those data with different capitals at the end of the same column indicated very significant differences (P<0.01).

3 討 論

建立多重PCR方法時在引物設(shè)計環(huán)節(jié)必須充分考慮目的檢測基因序列與實際擴增效果。PCV1與PCV2同屬于豬圓環(huán)病毒，二者不僅在全基因組大小與組成結(jié)構(gòu)方面相似，還在大多數(shù)核苷酸區(qū)域具有高度一致性[6]，故只能在兩段序列一致性較低的區(qū)域設(shè)計引物，同時還需通過實際擴增來檢測引物特異性。經(jīng)多次試驗后，本研究篩選出2對特異性引物，在實際擴增中能夠很好區(qū)分PCV1與PCV2。

通常情況下，多對引物存在于同一反應(yīng)體系中容易互相產(chǎn)生干擾作用，使得PCR反應(yīng)的敏感性降低而造成假陰性結(jié)果增多是多重PCR方法的主要缺陷。崔尚金等[9]建立的豬圓環(huán)病毒多重PCR檢測方法可以檢測到10 ng的總DNA濃度，推算出大致相當(dāng)于107copies/μL病毒DNA；徐磊等[10]建立的PCV1、PCV2a和PCV2b的多重PCR檢測方法中靈敏度分別為4.87×107、2.83×107、2.96×106copies/μL病毒DNA；二者較單項PCR方法的靈敏度降低了2個數(shù)量級。陳鉅豪[11]等建立的PCV1和PCV2雙重PCR鑒別診斷方法的靈敏度分別為0.1 ng和0.01 ng病毒核酸，推算出大致相當(dāng)于104～105copies/μL。本試驗建立的方法中PCV1和PCV2的靈敏度分別為1.7×103、4×103copies/μL病毒DNA，顯示出較前述研究報道更高的敏感性。對145份斷奶仔豬淋巴結(jié)的比較檢測顯示，兩種豬圓環(huán)病毒的雙重PCR檢測結(jié)果都接近于各自單項PCR檢測結(jié)果，二者之間的符合率分別為95.9%和94.5%；同時，建立的方法對當(dāng)前比較流行的豬源DNA病毒的檢測結(jié)果均為陰性，對臨床檢測陽性的樣品的隨機測序鑒定結(jié)果全部證實為特異目的產(chǎn)物。這些結(jié)果說明建立的雙重PCR檢測方法具有很好的特異性與較高的靈敏性，可應(yīng)用于臨床檢測。

對2013—2017年京津冀地區(qū)10個豬場145份斷奶仔豬淋巴結(jié)進(jìn)行了PCV1和PCV2的雙重PCR檢測，結(jié)果顯示，PCV1和PCV2的豬場陽性率與個體陽性率分別為53.3%、11.7%和100%、77.2%，都是PCV2極顯著(P<0.01)高于PCV1，說明當(dāng)前這些豬場中PCV2感染明顯多于PCV1感染。陳鉅豪[11]等對廣東省98份仔豬臨床病料的檢測發(fā)現(xiàn)PCV1和PCV2的檢出率分別為2.0%和38.8%；徐磊等[10]檢測了陜西省的56份臨床樣品，發(fā)現(xiàn)PCV1和PCV2的檢出率分別為57.14%和44.64%；于紅欣等[8]對京津等地40頭斷奶仔豬和60頭肥育豬的血清檢測結(jié)果顯示，PCV1陽性率分別為17.5%和38.3%；馬增軍等[12]檢測了京津冀地區(qū)22個豬場398份血清，發(fā)現(xiàn)PCV2平均血清陽性率為84.2%。本研究結(jié)果與上述報道結(jié)果顯示，中國大多數(shù)豬場存在很高的PCV2感染率，部分豬場還存在一定程度的PCV1感染率，但是PCV2感染在當(dāng)前多數(shù)豬群中較PCV1感染占有明顯優(yōu)勢。