溫海京，賈超偉, 2，劉芊麟，張喜喜，劉鑫宇，周雙海*

(1. 北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2. 門頭溝區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102300)

近年來(lái)，以豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)為主要病原引起的傳染性腹瀉給國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。PEDV和豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)都是專嗜胃腸道而致傳染性腹瀉的2種冠狀病毒[4]，二者感染致病后的臨床癥狀、病理變化和流行病學(xué)都非常相似，導(dǎo)致難以進(jìn)行臨床鑒別診斷，必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)與鑒別診斷。

目前，PCR技術(shù)因特異性強(qiáng)、敏感性高、能夠進(jìn)行早期快速檢測(cè)而被普遍用于傳染病與其病原的檢測(cè)與診斷。當(dāng)前檢測(cè)病原的PCR技術(shù)主要有常規(guī)PCR和熒光定量PCR，雖然后者在特異性與敏感性方面更高一籌[3, 5, 6]，但其需要昂貴設(shè)備、且檢測(cè)成本較高，故其實(shí)用性并不一定強(qiáng)于前者。單項(xiàng)PCR檢測(cè)方法在一次PCR反應(yīng)中只能檢測(cè)一種病原，多重PCR檢測(cè)方法在一次PCR反應(yīng)中可同時(shí)檢測(cè)多種病原而明顯提高檢測(cè)效率。本研究旨在建立一種能同時(shí)檢測(cè)PEDV與TGEV的雙重RT-PCR檢測(cè)方法，并進(jìn)行初步臨床檢測(cè)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 病毒模板與質(zhì)粒

TGEV、PEDV、豬輪狀病毒(PRoV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)等病毒模板和TGEV-M基因質(zhì)粒與PEDV-M基因質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)

針對(duì)PEDV(JQ023161)的M基因和TGEV(GQ374564)的M基因保守序列，用Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，引物序列分別為PU：5′-CCCGTTGATGAGGTGATTGA-3′、PD：5′-GGATGCTGAAAGCGAAAAAG-3′(目的片段大小為229 bp)和TU：5′-GTGAGTCATGCTTCA ACGGAG-3′、TD：5′-GACACCAGTTGGCACACCTT-3′(目的片段大小為419 bp)。

1.3 單項(xiàng)PCR方法條件的篩選

用2×Taq MasterMix建立25 μL PCR反應(yīng)體系，上、下游引物各10 pmol，DNA模板1.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 30 s，35 cycles；72℃ 10 min。取8L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。在此基礎(chǔ)上，分別對(duì)單項(xiàng)PCR反應(yīng)的退火溫度和引物濃度進(jìn)行篩選，以確定最佳單項(xiàng)PCR反應(yīng)條件。

1.4 雙重PCR方法條件的篩選

以單項(xiàng)PCR反應(yīng)體系和步驟為基礎(chǔ)，在單項(xiàng)PCR方法條件優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上對(duì)雙重PCR反應(yīng)的2種引物濃度比例進(jìn)行篩選，以確定最佳雙重PCR反應(yīng)條件。

1.5 雙重PCR方法的特異性與敏感性試驗(yàn)

以TGEV、PEDV、PRoV、CSFV與PRRSV等常見RNA病毒為模板來(lái)檢測(cè)該雙重RT-PCR檢測(cè)方法的特異性。選取6個(gè)稀釋度的TGEV-M基因質(zhì)粒濃度(4.9×105～4.9×100copies/L)與PEDV-M基因質(zhì)粒濃度(5.9×105～5.9×100copies/L)為模板來(lái)檢測(cè)該雙重RT-PCR方法的敏感性。

1.6 臨床樣品檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)分析

采集2013—2016年京津冀地區(qū)18個(gè)豬場(chǎng)的235份仔豬腹瀉糞樣，用1 mL滅菌生理鹽水對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，10 000 r/min離心3 min，取250 μL上清液，參照TRIzol Reagent試劑使用說(shuō)明書提取總RNA，并溶于15 μL DEPC處理過(guò)的ddH2O中，取5 μL RNA按照康為世紀(jì)生物科技有限公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以合成cDNA。用建立的PEDV和TGEV的雙重PCR檢測(cè)方法和單項(xiàng)PCR方法分別進(jìn)行檢測(cè)，并隨機(jī)選取3個(gè)檢測(cè)為陽(yáng)性樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定。用卡方檢驗(yàn)比較兩種方法檢測(cè)出的PEDV與TGEV的個(gè)體陽(yáng)性率、豬場(chǎng)陽(yáng)性率之間的差異和PEDV與TGEV的檢出率之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單項(xiàng)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

不同退火溫度的PCR擴(kuò)增結(jié)果(見圖1)顯示，TGEV與PEDV都是在退火溫度為51.4℃時(shí)目的條帶最亮，故選擇51.4℃左右作為最佳退火溫度。

注：A是TGEV；B是PEDV；M是DNA Marker；1-4是退火溫度分別為49.6、51.4、53.9、55.8℃；5是陰性對(duì)照。Note: M was DNA Marker; 1-4 was different annealing temperature (49.6, 51.4, 53.9, 55.8℃); 5 was negative control.圖1 單項(xiàng)PCR退火溫度的篩選Fig.1 Screening of annealing temperature for the single PCR

不同引物濃度的PCR擴(kuò)增結(jié)果(見圖2)顯示，TGEV和PEDV都是在引物濃度為2.0mol/L或4.0mol/L時(shí)目的條帶更亮，因此選擇2.0mol/L至4.0mol/L作為2種引物的最佳濃度范圍。

注：A是TGEV；B：PEDV；M是DNA Marker；1-5是引物濃度分別為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mol/L。Note: M was DNA Marker; 1-5 was different primer concentration (1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 mol/L).圖2 單項(xiàng)PCR引物濃度的篩選Fig.2 Screening of primer concentration for the single PCR

2.2 雙重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

不同引物濃度比例的PCR擴(kuò)增結(jié)果(見圖3)顯示，PEDV與TGEV引物濃度比例為2.0mol/L比4.0mol/L時(shí)2條目的條帶都較亮，故確定為最佳引物濃度比例。

注：M是DNA Marker；1-4是PEDV與TGEV引物濃度比例分別為2.0 mol/L比2.0 mol/L、2.0 mol/L比4.0 mol/L、4.0 mol/L比2.0 mol/L、4.0 mol/L 比4.0 mol/L；5是陰性對(duì)照。Note: M was DNA Marker; 1-4 was different ratio of primer concentration for PEDV to TGEV (2.0 mol/L to 2.0 mol/L, 2.0 mol/L to 4.0 mol/L, 4.0 mol/L to 2.0 mol/L, 4.0 mol/L to 4.0 mol/L); 5 was negative control.圖3 雙重PCR引物濃度的篩選Fig.3 Screening of primer concentration for the duplex PCR

2.3 雙重PCR方法的特異性與敏感性

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，僅含有PEDV、TGEV的模板擴(kuò)增出特異性目的產(chǎn)物條帶，表明建立的雙重RT-PCR檢測(cè)方法有良好特異性(圖4)。

注：M是DNA Marker；1-6分別為病毒模板PEDV+TGEV、TGEV、PEDV、PRoV、PRRSV、CSFV；7是陰性對(duì)照。Note: M was DNA Marker; 1-6 was virus template (PEDV+TGEV, TGEV, PEDV, PRoV, PRRSV, CSFV); 7 was negative control.圖4 雙重PCR的特異性試驗(yàn)Fig.4 The specificity of the duplex PCR

敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，能夠擴(kuò)增出PEDV與TGEV的特異目的條帶的最低模板濃度分別為5.9×101、4.9×101copies/L，故確定這2個(gè)濃度為建立的雙重RT-PCR檢測(cè)方法的相應(yīng)靈敏度(圖5)。

注：M是DNA Marker；1-6是PEDV和TGEV的質(zhì)粒濃度分別為5.9×105～5.9×100、4.9×105～4.9×100 copies/L；7是陰性對(duì)照。Note: M was DNA Marker; 1-6 was plasmid concentration of PEDV (5.9×105～5.9×100 copies/L) and TGEV (4.9×105～4.9×100 copies/L); 7 was negative control.圖5 雙重PCR的敏感性試驗(yàn)Fig.5 The sensitivity of the duplex PCR

2.4 臨床樣品的檢測(cè)與分析

用PEDV與TGEV的單項(xiàng)RT-PCR和雙重RT-PCR方法對(duì)2013—2016年京津冀地區(qū)18個(gè)豬場(chǎng)的傳染性腹瀉仔豬糞樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，PEDV的單項(xiàng)RT-PCR與雙重RT-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率分別在60.0%～93.3%、58.3.0%～86.7%之間，其總個(gè)體陽(yáng)性率分別為79.1%、73.6%，二者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，其符合率為94.5%；TGEV的單項(xiàng)RT-PCR與雙重RT-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率分別在0%～15.4%、0%～8.3%之間，其總個(gè)體陽(yáng)性分別為3.4%、2.1%，二者之間也無(wú)顯著性差異(P>0.05)，其符合率為98.7%(表1)。隨機(jī)選取3個(gè)檢測(cè)為陽(yáng)性樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆與測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示所克隆序列與相應(yīng)參考序列的核苷酸同源率均達(dá)99%以上，再次證實(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果為PEDV或TGEV，說(shuō)明臨床檢測(cè)結(jié)果有很好的特異性。雙重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床疑似PEDV和/或TGEV感染樣品的檢出率非常接近其單項(xiàng)RT-PCR檢測(cè)方法，表明該雙重RT-PCR檢測(cè)方法可用于臨床檢測(cè)。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PEDV的個(gè)體陽(yáng)性率超過(guò)70%而極顯著(P<0.01)高于TGEV的不足5.0%(表1)。同時(shí)，PEDV的豬場(chǎng)陽(yáng)性率為100%，也極顯著(P<0.01)高于TGEV的27.8%。

表1 臨床樣品中PEDV與TGEV的檢出率比較Tab.1 Comparison of detection rate of PEDV and TGEV

注：同列數(shù)據(jù)尾部有不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Those data with different capitals at the end of the same column indicated very significant differences (P<0.01).

3 討 論

引物設(shè)計(jì)是多重PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)，必須考慮所擴(kuò)增檢測(cè)的病原基因序列與實(shí)際擴(kuò)增效果。PEDV與TGEV同屬于冠狀病毒，二者基因組大小與組成相似，其M基因與N基因適合作為檢測(cè)目的基因[7]。在前期建立檢測(cè)PEDV與TGEV的熒光定量PCR方法過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)M基因的擴(kuò)增效果均明顯優(yōu)于N基因[3, 6]，故均選用M基因作為檢測(cè)PEDV與TGEV的目的基因來(lái)設(shè)計(jì)引物。在比較試驗(yàn)3對(duì)TGEV引物和2對(duì)PEDV引物后，篩選出試驗(yàn)中的2對(duì)特異性引物。

多重PCR檢測(cè)方法的困難主要在于同一個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物時(shí)，多對(duì)引物之間容易產(chǎn)生互相干擾而降低PCR反應(yīng)的敏感性。多重PCR檢測(cè)方法的敏感性往往低于單項(xiàng)PCR方法，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。一些研究者建立PEDV和TGEV的雙重RT-PCR方法，但其檢測(cè)敏感性各不相同。陳芳[8]等與賈銳[9]等建立的方法的靈敏度介于10～100 pg/L病毒核酸，推算出大致相當(dāng)于104～106copies/L；鄭世民[10]等建立的方法的靈敏度分別為9.6、7.3 TCID50/0.1 mL病毒核酸，推算出大致相當(dāng)于100～200 copies/L；劉鄧等[11]建立的方法的靈敏度均為100 copies/L。本試驗(yàn)建立的方法對(duì)PEDV和TGEV的檢測(cè)靈敏度分別為59、49 copies/L，較這些研究者建立的方法有所提高甚至明顯提高；對(duì)235份仔豬腹瀉病料的比較檢測(cè)顯示，2種冠狀病毒的雙重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果接近于單項(xiàng)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，二者之間的符合率分別為94.5%和98.7%；同時(shí)，所建立的方法對(duì)當(dāng)前比較流行的豬源RNA病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，對(duì)臨床檢測(cè)陽(yáng)性的樣品的隨機(jī)測(cè)序鑒定結(jié)果也全部證實(shí)為特異目的產(chǎn)物；說(shuō)明所建立的雙重RT-PCR檢測(cè)方法具有很高的靈敏性與很好的特異性，可應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

對(duì)2013—2016年18個(gè)豬場(chǎng)的235份仔豬腹瀉病料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，PEDV和TGEV的豬場(chǎng)陽(yáng)性率與總個(gè)體陽(yáng)性率分別為100.0%、73.6%和27.8%、2.1%，PEDV極顯著高于TGEV。任玉鵬等[14]對(duì)四川省6個(gè)豬場(chǎng)46份腹瀉病料的檢測(cè)顯示PEDV和TGEV的感染率分別為76.1%和19.6%，未檢出輪狀病毒；王元等[15]對(duì)新疆10個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)159份腹瀉病料的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PEDV和TGEV的感染率分別為62.9%和0%；孟凡偉等[3]、張雪等[6]對(duì)2011—2013年北京、天津地區(qū)10個(gè)豬場(chǎng)139份腹瀉樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，TGEV和PEDV的豬場(chǎng)陽(yáng)性率與總個(gè)體陽(yáng)性率分別為40%、9.4%和100.0%、76.2%，在豬場(chǎng)陽(yáng)性率和個(gè)體陽(yáng)性率兩個(gè)方面，PEDV的檢出率均顯著高于TGEV的檢出率。仔豬傳染性腹瀉在中國(guó)自2010年冬季暴發(fā)以來(lái)，至今在不少地方仍然流行，這些資料均來(lái)自于2010年以來(lái)中國(guó)部分地區(qū)數(shù)據(jù)。綜合分析發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)發(fā)生傳染性腹瀉的豬場(chǎng)中，PEDV檢出率非常明顯地高于TGEV檢出率，提示在當(dāng)前豬傳染性腹瀉流行情況下，PEDV較TGEV更需值得關(guān)注與防控。