李 博，洪 鵬，沈宏亮，楊 金，卜春亞

(北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院/農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)是一種世界廣泛分布的害螨，具有繁殖速度快、種群密度大、個(gè)體小、極易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，所以防治十分困難[1-3]。此外，朱砂葉螨取食范圍廣，對(duì)果樹(shù)以及玉米和棉花等農(nóng)作物均造成不同程度上的危害[4-6]。有研究表明，朱砂葉螨已經(jīng)對(duì)多種殺螨劑產(chǎn)生抗性[7,8]。每年中國(guó)需要很大部分的費(fèi)用支出用于害螨的防治，并且至今仍處于不斷上漲的趨勢(shì)中[5,9,10]。且傳統(tǒng)的殺螨劑，如有機(jī)磷類或氨基甲酸酯類殺螨劑，具有物種選擇性差、易對(duì)螨產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)[11]。開(kāi)發(fā)和研制新型對(duì)朱砂葉螨有毒殺作用，但對(duì)其他非靶標(biāo)有益生物無(wú)害的殺螨劑，具有十分重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。

幾丁質(zhì)(chitin)，是通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接聚合N-乙酰葡糖胺形成的線性多聚物[12]，又名殼多糖。幾丁質(zhì)酶(chitinase)是一種幾丁質(zhì)水解酶，最先在1921年由Folpmers從細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)并提出[13]。幾丁質(zhì)酶可以將幾丁質(zhì)降解為分子量較低的二糖或三糖[14]，在昆蟲(chóng)體內(nèi)幾丁質(zhì)酶的功能為降解圍食膜與更替新舊表皮[15-17]。

在幾丁質(zhì)酶的8種類型[17-20]中，Ⅰ型幾丁質(zhì)酶是最具有特征的，其包括一個(gè)信號(hào)肽(signal peptide)、一個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)(chitin-binding domain)、一個(gè)連接糖基化位點(diǎn)與磷酸化位點(diǎn)的連接區(qū)(linker)與一個(gè)活性位點(diǎn)區(qū)(catalytic domain)。Ⅰ型幾丁質(zhì)酶Cht1，其主要參與更替新舊表皮過(guò)程中對(duì)舊表皮的消化過(guò)程。

目前，哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、中國(guó)被毛孢(Hirsutellasinensis)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、玉米螟(Pyraustanubilalis)、二化螟(Chilosuppressalis)、二斑葉螨(Tetranychusurticae)等幾丁質(zhì)酶基因已被成功表達(dá)[21-24]，關(guān)于蜱螨目幾丁質(zhì)酶表達(dá)的研究較少。幾丁質(zhì)在高等動(dòng)植物中并不存在，參與昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)代謝的酶類被認(rèn)為是很好的殺蟲(chóng)劑靶標(biāo)，幾丁質(zhì)酶作為新型殺螨劑的潛在靶標(biāo)，有著十分廣闊的應(yīng)用前景和實(shí)踐意義。

本研究以本實(shí)驗(yàn)室克隆的朱砂葉螨TecCht1基因?yàn)榛A(chǔ)，對(duì)其催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行擴(kuò)增，于pCold Ⅱ載體上進(jìn)行原核體外表達(dá)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，對(duì)純化后的目的蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定。為朱砂葉螨TecCht1的抗體制備、功能研究以及殺螨劑的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

菌株和載體：Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pCold Ⅱ原核表達(dá)載體購(gòu)自Takara公司；菌株DH5α、BL21購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司。

主要試劑：T4連接酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TIANgel Midi Purification Kit、TIANpure Mini Plasmid Kit、2X Taq Mix購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；EX Taq酶、dNTP Mix、限制性內(nèi)切酶(Sac Ⅰ和 EcoR Ⅰ)DNA Marker Ⅲ購(gòu)自Takara公司；Cocktail蛋白酶抑制、一步法Western Blot試劑盒購(gòu)自江蘇康為生化試劑有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 在本實(shí)驗(yàn)室已克隆的TecCht1基因以及結(jié)構(gòu)域分析的基礎(chǔ)上，利用Primer Premier 6.0，設(shè)計(jì)帶有 Sac Ⅰ和 EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)，以及上游加His-tag標(biāo)簽的上、下游引物，用于擴(kuò)增TecCht1基因的催化結(jié)構(gòu)域區(qū)域的引物：TecCht1-F1為5′-CATCATCATCATCATCATGAGCTCGATAAAGTGTTGATATGT-3′，TecCht1-R1為5′-GAATTCTCAAGTACCAAGGAAATCATC-3′。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增 以實(shí)驗(yàn)室保存的T/TecCht1為模板，TecCht1-F1、TecCht1-R1作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)。將目的條帶膠塊，用TIANgel Mini Purification Kit回收。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 55 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。

1.2.3 原核表達(dá)載體pCold Ⅱ/TecCht1的構(gòu)建 將1.2.2步驟回收獲得的PCR產(chǎn)物與載體pCold Ⅱ質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶 Sac Ⅰ和 EcoR Ⅰ進(jìn)行雙酶切反應(yīng)。 37℃酶切2 h后，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物并回收目的基因及載體的DNA片段，隨后用T4 DNA Ligase連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性克隆菌落。使用TIANpure Mini Plasmid Kit進(jìn)行質(zhì)粒的提取，隨后進(jìn)行雙酶切鑒定，將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒交由生工生物工程(股份)有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組載體用于TecCht1的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.4 TecCht1的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序正確的 pCold Ⅱ/TecCht1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，接種于3 mL含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600nm=0.6后，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。將此菌液全部加入到100 mL含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中， 37℃恒溫180 r/min震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至 OD600nm值達(dá)到0.4～0.6；向全部菌液中加入終濃度為1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，15℃，110 r/min振蕩培養(yǎng)，18、20、22、24、26、28、32 h分別取1 mL 菌液留樣，利用SDS-PAGE電泳檢測(cè)TecCht1表達(dá)量的情況，以及表達(dá)量與誘導(dǎo)時(shí)間的關(guān)系，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為24 h。

1.2.5 TecCht1重組蛋白的可溶性分析 將含有pCold Ⅱ/TecCht1質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)菌株劃線培養(yǎng)，挑取單菌落，經(jīng)3、100、1 000 mL的逐級(jí)放大培養(yǎng)后，加入終濃度為1 mmol/L的 IPTG，溫度為15℃，110 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，離心收集菌體沉淀。用PBS(pH 8.0)緩沖液洗滌后，沉淀用20 mL PBS緩沖液重懸，加入200 μL Cocktail蛋白酶抑制劑于垂直混合器中4℃反應(yīng)1 h。功率380 w超聲3 s，冷卻10 s為一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行170個(gè)循環(huán)破碎菌體；裂解完成后將裂解液于4℃ 7 800 r/min離心15 min，收集破碎后的上清和菌體沉淀。電泳分析重組蛋白的可溶性，電泳檢測(cè)目的蛋白主要在沉淀中。

1.2.6 TecCht1重組蛋白的純化 將收集的菌體沉淀用緩沖液A(140 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、1.8 mmol/L KH2PO4、8 mol/L尿素、10 mmol/L Na2HPO4)超聲溶解。4℃條件下離心15 min。將上清液加至已平衡的5 mL Ni-NTA中，顛倒混勻結(jié)合過(guò)夜后，用50 mL結(jié)合緩沖液A洗去未結(jié)合蛋白。用50 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗去與Ni-NTA非特異結(jié)合蛋白，200 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫，收集TecCht1重組蛋白組分，測(cè)定組分OD280nm值，SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化情況。采用Amicon?Ultra-15將純化的重組蛋白溶液進(jìn)行尿素的梯度去除以及超濾濃縮，先置換成含8 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液；隨后分別用6 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液、4 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液、2 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液與不含尿素的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液進(jìn)行梯度置換，濃縮后的目的蛋白保存于-80℃。

1.2.7 TecCht1重組蛋白的Western Blot鑒定 為進(jìn)一步驗(yàn)證目的蛋白的特異性，將目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。按照康為世紀(jì)一步法Western Blot試劑盒的操作，以兔源抗His-tag抗體為一抗，加入抗體孵育45 min，經(jīng)洗膜后用ECL顯色液顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的擴(kuò)增

對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，目的條帶大小正確，將目的條帶進(jìn)行膠回收(圖1)。

注：M: DNA MarkerⅢ，1-2：TecCht1。Note: M indicates DNA MarkerⅢ, and 1-2 indicate TecCht1.圖1 目的片段的擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of the target fragment

2.2 重組載體的雙酶切驗(yàn)證

將PCR回收產(chǎn)物與pCold Ⅱ空載體分別雙酶切，連接轉(zhuǎn)化后，進(jìn)行重組載體的雙酶切驗(yàn)證。陽(yáng)性克隆雙酶切后出現(xiàn)2條條帶，大小與空載體和目的片段的大小相符，陽(yáng)性克隆測(cè)序驗(yàn)證正確，說(shuō)明pCold Ⅱ/TecCht1原核表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖2)。

注：M:DNA MarkerⅢ，1-2：重組載體。Note:M indicates DNA MarkerⅢ, and 1-2 indicate recombinant vectors.圖2 重組載體雙酶切驗(yàn)證Fig.2 Restriction enzyme analysis of recombinant vectors

2.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將pCold Ⅱ/TecCht1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)條件摸索。當(dāng)誘導(dǎo)表達(dá)溫度為15℃，IPTG終濃度為1 mmol/L，110 r/min振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)18、20、22、24、26、28、32 h后分別取樣1 mL，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，出現(xiàn)大小約42.3 kDa的目的條帶，條帶大小與目的蛋白的分子量一致。且在誘導(dǎo)表達(dá)24 h目的蛋白的條帶最粗，且當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間大于24 h，菌體對(duì)目的蛋白的表達(dá)量趨于穩(wěn)定，所以確定誘導(dǎo)24 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)間，可用于后續(xù)蛋白的大量表達(dá)純化(圖3)。

注：M：蛋白Marker 1：未誘導(dǎo)表達(dá)的全菌；2-8：誘導(dǎo)表達(dá)18、20、22、24、26、28、32 h后的全菌。Note: M indicates protein Marker, and 1 indicates no IPTG induction control, and 2-8 indicate bacteria proteins induced for 18、20、22、24、26、28、32.圖3 IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間表達(dá)的TecCht1 SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of TecCht1 expression induced by IPTG

2.4 目的蛋白的可溶性分析

將離心收集的誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體沉淀，加入PBS緩沖液重懸，經(jīng)超聲破碎后，分別對(duì)上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。目的蛋白幾乎都在破碎后的沉淀中，表明目的蛋白為包涵體表達(dá)(圖4)。

注：M：蛋白Marker 1：未誘導(dǎo)表達(dá)的全菌；2：誘導(dǎo)表達(dá)24 h后的全菌3：破碎后的上清液4：破碎后的沉淀。Note: M indicates protein Marker, and 1 indicates no IPTG induction control, and 2 indicates bacteria proteins induced for 24 h, and 3 indicates supernatant after ultrasonic disruption, and 4 indicates pellet after ultrasonic disruption.圖4 SDS-PAGE分析表達(dá)的TecCht1的可溶性Fig.4 SDS-PAGE analysis of solubility of expressed TecCht1

2.5 目的蛋白純化

將包涵體溶解離心后的上清液與Ni-NTA柱料結(jié)合，在4℃條件下純化目的蛋白，隨后進(jìn)行復(fù)性，置換緩沖液，超濾濃縮后，進(jìn)行SDS-PAGE分析。在43 kDa左右出現(xiàn)單一條帶，說(shuō)明獲得純度較高的目的蛋白(圖5)。

注：M：蛋白Marker 1：純化后的目的蛋白。Note: M indicates protein Marker, and 1 indicates purified TecCht1.圖5 純化后的TecCht1蛋白的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified TecCht1

2.6 目的蛋白的Western Blot分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證目的蛋白的特異性，將純化后的蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。在43 kDa左右出現(xiàn)特異性的目的條帶，說(shuō)明目的蛋白在pCold Ⅱ中成功表達(dá)，獲得較純的目的蛋白(圖6)。

注：M：蛋白Marker 1：純化后的目的蛋白。Note: M indicates protein Marker, and 1 indicates purified TecCht1.圖6 純化后的TecCht1蛋白的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of purified TecCht1

3 討 論

幾丁質(zhì)是昆蟲(chóng)表皮和圍食膜的重要組成之一，研究表明昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶的功能為降解圍食膜與更替新舊表皮[15-17]，它具有發(fā)育時(shí)期階段性表達(dá)的特點(diǎn)。幾丁質(zhì)酶表達(dá)水平的變化可能是致命的。在防治中，幾丁質(zhì)酶本身可作為生物農(nóng)藥[25]，在飼料中添加，會(huì)加強(qiáng)其他農(nóng)藥對(duì)害螨的毒殺作用[26]，但因其純化工藝具有較高的成本，幾丁質(zhì)酶的實(shí)際生物防治效果還有待于進(jìn)一步深入研究。

大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)的一種重要工程菌，其最大的特點(diǎn)是有著清晰的遺傳背景，且其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，能夠在短時(shí)間內(nèi)大量表達(dá)外源蛋白，且其成本低和使用方便。存在容易形成包涵體的特點(diǎn)，經(jīng)過(guò)變性復(fù)性過(guò)程，可能使蛋白喪失活性。在表達(dá)真核蛋白時(shí)，不具備轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程，容易導(dǎo)致蛋白的不正確折疊。

李宏偉等[27]用pET 32a 載體在大腸桿菌中表達(dá)美洲大蠊幾丁質(zhì)酶基因； Tetsuro Shinoda等[28]在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)斜紋夜蛾幾丁質(zhì)酶基因；但棉鈴蟲(chóng)幾丁質(zhì)酶在pET 21b載體未成功表達(dá)[29]。本研究采用pCold Ⅱ冷休克表達(dá)載體，有助于解決TecCht1基因表達(dá)難的問(wèn)題。

本研究成功構(gòu)建pCold Ⅱ/TecCht1表達(dá)載體，通過(guò)15℃低溫誘導(dǎo)，成功表達(dá)朱砂葉螨TecCht1蛋白，并摸索出其最適誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為24 h。以最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)目的蛋白的變性和復(fù)性，成功獲得純度較高的TecCht1蛋白。為朱砂葉螨TecCht1蛋白抗體的制備和功能研究奠定基礎(chǔ)，為研制新型選擇性殺螨劑提供新思路。