李春春，茍玉萍，張克信，張強(qiáng)艷，劉長(zhǎng)仲

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070）

關(guān) 鍵 字：幾丁質(zhì)酶；功能分析；害蟲防治；應(yīng)用

我國(guó)地域遼闊，自然環(huán)境復(fù)雜多樣，有害生物種類繁多，數(shù)量巨大。其中害蟲作為主要的有害生物之一，每年對(duì)我國(guó)農(nóng)林牧草造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，害蟲的防治主要依賴于化學(xué)藥劑，且藥劑施用量大、施用次數(shù)多，以致害蟲容易產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防治困難，從而造成惡性循環(huán)。我國(guó)是農(nóng)藥使用量最多的國(guó)家之一，農(nóng)藥污染，有悖于生態(tài)環(huán)境保護(hù)、且對(duì)人畜產(chǎn)生殘留毒害，農(nóng)藥減量增效是我國(guó)今后較長(zhǎng)時(shí)期的一項(xiàng)艱巨任務(wù)[2]。因此，探索農(nóng)林牧草害蟲綠色防控的新途徑尤為重要。

幾丁質(zhì)（Chitin），是由氨N-乙?；咸烟牵℅lcNAc）通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接而成的線性多糖聚合物，也稱為殼多糖、甲殼素、甲殼質(zhì)，不溶于水和多數(shù)有機(jī)溶劑，是自然界中貯量?jī)H次于纖維素的一種含氮的多糖[3]。昆蟲幾丁質(zhì)主要存在于昆蟲的外骨骼、腸道、氣管以及口器和唾液腺中，是昆蟲體壁、氣管和中腸圍食膜等結(jié)構(gòu)的重要組成部分，起著維持昆蟲特定形態(tài)，抵御機(jī)械損傷和病原物侵害的重要作用[4,5]。幾丁質(zhì)的合成與降解在昆蟲體內(nèi)維持著動(dòng)態(tài)平衡，如果幾丁質(zhì)的含量在昆蟲某一時(shí)期升高或降低，則會(huì)影響昆蟲的正常生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)構(gòu)造?？梢姡瑤锥≠|(zhì)對(duì)昆蟲的生命活動(dòng)而言是不可或缺的。然而，高等植物和動(dòng)物并不具有幾丁質(zhì)代謝系統(tǒng)，因此，選擇調(diào)控昆蟲幾丁質(zhì)酶來(lái)破壞昆蟲幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)或幾丁質(zhì)代謝來(lái)防治害蟲，具有很大的發(fā)展?jié)摿?。通過(guò)對(duì)昆蟲幾丁質(zhì)酶相關(guān)基因的功能研究發(fā)現(xiàn)，沉默昆蟲幾丁質(zhì)酶基因能打破昆蟲幾丁質(zhì)代謝平衡，抑制幾丁質(zhì)的合成并導(dǎo)致昆蟲蛻皮困難、出現(xiàn)高的死亡率[6-8]，這表明昆蟲幾丁質(zhì)酶能夠作為害蟲的控制靶標(biāo)。因此，在害蟲防治體系中，掌握昆蟲幾丁質(zhì)酶調(diào)控機(jī)理對(duì)于制定新型防治策略與技術(shù)研發(fā)具有重要意義。

1 昆蟲幾丁質(zhì)代謝途徑

昆蟲會(huì)定期蛻皮，脫落舊的外骨骼，并合成新的外骨骼，以便維持正常的生長(zhǎng)發(fā)育。這種不斷替換的過(guò)程就是由幾丁質(zhì)合成和降解酶系協(xié)同作用完成的昆蟲幾丁質(zhì)代謝過(guò)程。昆蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)生物合成途徑以昆蟲血糖——海藻糖為前提物，經(jīng)過(guò)一系列的生理和生化反應(yīng)，終由幾丁質(zhì)合酶（chitin synthase，CHS）合成幾丁質(zhì)。昆蟲幾丁質(zhì)降解途徑主要由幾丁質(zhì)酶將幾丁質(zhì)最終降解為N-乙酰氨基葡萄糖單體（GlcNAc），這些游離的GlcNAc能再次用于幾丁質(zhì)的重建（圖1）[9,10]。

圖1 昆蟲幾丁質(zhì)的代謝途徑[9,10]Fig. 1 Chitin metabolic pathway in insects[9,10]

2 昆蟲幾丁質(zhì)酶

2.1 昆蟲幾丁質(zhì)酶的基因克隆

昆蟲幾丁質(zhì)酶（Chitinase，Cht）是一類具有抑制或降解幾丁質(zhì)潛力的水解酶，包括內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和外切幾丁質(zhì)酶2種[11]。廣義上的昆蟲幾丁質(zhì)酶是指內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，作用于β-1,4-糖苷鍵，把幾丁質(zhì)水解為可溶性的小分子寡糖和低聚糖，然后再由外切酶水解產(chǎn)生N-乙酰葡萄糖胺單體，用以形成新的表皮[12,13]。

1993年，Kramer等[14]首次從煙草天蛾Manduca sexta中克隆到一條長(zhǎng)為2452 bp編碼554個(gè)氨基酸的幾丁質(zhì)酶基因。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)飛速發(fā)展，越來(lái)越多昆蟲幾丁質(zhì)酶基因被克隆和驗(yàn)證，如黑腹果蠅Drosophila melanogaster、赤擬谷盜Tribolium castaneum、褐飛虱Nilaparvata lugens等，且不同昆蟲擁有的Cht基因數(shù)量有所不同（表1）。

表1 幾種昆蟲的幾丁質(zhì)酶基因（Cht）數(shù)量Table 1 Number of chitinase genes (Cht) in several insects

2.2 昆蟲幾丁質(zhì)酶及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

昆蟲幾丁質(zhì)酶的分子量在45～85 kDa，等電點(diǎn)在5.0～7.0，大多屬于18家族幾丁質(zhì)酶[23]。昆蟲幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)酶樣蛋白存在四個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：信號(hào)肽（Signal peptide, SP）、催化區(qū)域（Catalytic domains,CD）、富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的S/T連接區(qū)域（Serine/Threonine-Rich Linker Region，S/T Linker）和C端幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)域（Chitin-binding domain，CBD）[24]，以模式昆蟲果蠅為例，其幾丁質(zhì)酶樣蛋白的結(jié)構(gòu)域如圖2所示?；谙到y(tǒng)發(fā)育分析、時(shí)空表達(dá)特異性和蛋白結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)，昆蟲Cht和Cht類似蛋白主要?jiǎng)澐譃榘藗€(gè)組（Group I～Ⅷ），其各組的幾丁質(zhì)酶序列結(jié)構(gòu)特征如表2所示[25,26]。

圖2 果蠅幾丁質(zhì)酶樣蛋白的結(jié)構(gòu)域[21]Fig. 2 Domain architecture of identified Drosophila chitinase-like proteins[21]

表2 昆蟲幾丁質(zhì)酶I～VIII不同類型的序列結(jié)構(gòu)域[25,26]Table 2 Domain architecture of group I—VIII insect chitinases[25,26]

3 昆蟲幾丁質(zhì)酶基因調(diào)節(jié)昆蟲幾丁質(zhì)代謝

3.1 昆蟲幾丁質(zhì)酶調(diào)控機(jī)制的多樣性與復(fù)雜性

昆蟲幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)具有特異性。Cht5和Cht10基因在赤擬谷盜和岡比亞按蚊的腸道組織幾乎不表達(dá)，但在體壁組織具有較高的mRNA水平[19,22]；然而，云杉色卷蛾Choristoneura fumiferana的腸道組織中能檢測(cè)到幾丁質(zhì)酶，但在表皮中檢測(cè)不到與蛻皮相關(guān)的幾丁質(zhì)酶cDNA[27]，說(shuō)明腸道和表皮可能表達(dá)不同的組織特異性幾丁質(zhì)酶。MsCht1僅在煙草天蛾雄蟲精巢和雌蟲卵巢中特異性高表達(dá)[28]，BdCht1在橘小實(shí)蠅卵巢組織也具有較高的表達(dá)量[29]。與此不同，在褐飛虱雌蟲生殖器官高表達(dá)的幾丁質(zhì)酶基因主要為NlCht2和NlCht6[18]，這說(shuō)明物種差異使得在參與卵發(fā)育過(guò)程中的幾丁質(zhì)酶基因有所不同。此外，不同的幾丁質(zhì)酶基因在昆蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)也存在特異性。扶桑棉粉蚧PsCht2在2齡若蟲高表達(dá)，PsCht10、PsCht3-3和PsIDGF在雌性成蟲中高表達(dá)，而PsCht4和PsCht4-1在雄性蛹和雄性成蟲中高表達(dá)[6]。橘小實(shí)蠅BdCht1、BdCht7和BdCht10在幼蟲生長(zhǎng)和蛻皮過(guò)程中均有較高表達(dá)量[29]。

昆蟲幾丁質(zhì)酶在昆蟲蛻皮過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但并非所有幾丁質(zhì)酶都在蛻皮的各個(gè)階段發(fā)揮作用。在橘小實(shí)蠅中，在幼蟲體壁組織高表達(dá)的基因有BdIDGF和BdCht2，而其他的幾丁質(zhì)酶基因均在成蟲體壁組織具有較高的表達(dá)量，BdCht8在成蟲中腸組織特異性高表達(dá)[29]。赤擬谷盜的TcCht10有助于幼蟲-幼蟲、幼蟲-蛹和蛹-成蟲階段的蛻皮，而TcCht5只在蛹-成蟲蛻皮中起作用[19]，這表明幾丁質(zhì)酶調(diào)控機(jī)制存在多樣性和復(fù)雜性。

3.2 昆蟲幾丁質(zhì)酶基因的功能分析

幾丁質(zhì)酶是在昆蟲蛻皮過(guò)程中用來(lái)消化其外骨骼和腸道內(nèi)壁中的一組蛋白質(zhì)[30]，其功能涉及生長(zhǎng)發(fā)育、蛻皮、食物消化、生殖和先天免疫等多個(gè)方面。它們能夠與昆蟲腸道和角質(zhì)層內(nèi)圍食膜的幾丁質(zhì)成分結(jié)合，導(dǎo)致含有幾丁質(zhì)基質(zhì)的降解和生物體的死亡[31,32]。目前，大量研究通過(guò)體外合成dsRNA，并經(jīng)飼喂或注射方式使幼蟲攝取，干擾相應(yīng)幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)，來(lái)觀察其對(duì)昆蟲不同發(fā)育階段的影響。

白背飛虱Sogatella furcifera[33]、黏蟲Mythimna separata[34]等昆蟲的Cht7基因在昆蟲蛻皮前后表達(dá)量變化顯著，說(shuō)明Cht7基因與該昆蟲的蛻皮相關(guān)；同樣，當(dāng)RNAi成功抑制黑腹果蠅DmCht7基因的表達(dá)后，該蟲外形發(fā)生明顯變化，1齡幼蟲的表皮發(fā)生破裂，2齡和3齡幼蟲的頭殼和身體后部的氣門發(fā)生了明顯的變形，且在蛹-成蟲的分化階段易出現(xiàn)蛻皮困難、成蟲不能成功展翅等現(xiàn)象[35]。赤擬谷盜和褐飛虱中的4～5個(gè)幾丁質(zhì)酶家族成員能夠?qū)ζ洚a(chǎn)生致死表型：在赤擬谷盜中，TcCht5在蛹-成蟲期起重要作用，TcCht10與幼蟲-幼蟲、幼蟲-蛹、蛹-成蟲和卵的孵化有關(guān)，TcCht7在成蟲翅原基及翅鞘的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19,36]；在褐飛虱中，NlCht1、NlCht5、NlCht7、NlCht9、NlCht10能夠影響若蟲蛻皮，使褐飛虱出現(xiàn)不同程度的致死表型[37]；RNAi褐飛虱的NlCht2、NlCht3、NlCht6、NlCht8和NlCht7后，該蟲足前附肢的趾鉤消失以致影響行走和彈跳，最終導(dǎo)致死亡[36,38]。同樣，BdCht5能調(diào)控橘小實(shí)蠅幼蟲-蛹和蛹-成蟲變態(tài)過(guò)程中幾丁質(zhì)的降解[39]；PsCht4或PsCht4-1能導(dǎo)致扶桑棉粉蚧蛻皮失敗，沉默PsCht5導(dǎo)致化蛹缺陷，飼喂dsCht10導(dǎo)致3齡若蟲體型變小，5 d后全部死亡[6]。最新研究發(fā)現(xiàn)，DmCht10可控制果蠅翅角質(zhì)層中幾丁質(zhì)的數(shù)量和組織，抑制DmCht10后，果蠅翅表皮幾丁質(zhì)總量過(guò)度累積，進(jìn)而導(dǎo)致幾丁質(zhì)的排布紊亂，片層結(jié)構(gòu)破壞，不利于昆蟲角質(zhì)層和翅表皮的形成[40]。

綜上所述，無(wú)論各個(gè)Cht具有怎樣的差別，都能影響昆蟲幾丁質(zhì)代謝，并且造成一定的昆蟲死亡率。幾丁質(zhì)酶不僅有其特定的功能，而且在整個(gè)機(jī)體內(nèi)相互作用，共同調(diào)控著昆蟲幾丁質(zhì)的運(yùn)行，通過(guò)昆蟲幾丁質(zhì)酶調(diào)控昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育來(lái)防治害蟲，是一種潛在的生物殺蟲途徑和方法。

4 影響昆蟲幾丁質(zhì)酶活性的因素

4.1 溫度與pH

大多數(shù)昆蟲幾丁質(zhì)酶的最適pH約為4～10，最適溫度約為40 ℃～60 ℃，熱穩(wěn)定性一般在4 ℃～60 ℃[41]。然而，當(dāng)作用底物不同時(shí)，幾丁質(zhì)酶活性也存在差異。例如，使用寡聚底物4MU(GlcNAc)3時(shí)，飛蝗LmCht5-1和LmCht5-2的最適pH為6；使用多聚底物CM-Chtitin-RBV時(shí)，二者的最適pH為9[42]。此外，溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶具有調(diào)控作用。對(duì)橘小實(shí)蠅的最新研究發(fā)現(xiàn)，在高溫組（45 ℃處理1 h）中，成功存活昆蟲的IDGF4表達(dá)量是對(duì)照組（25 ℃處理5 h）的3.15倍，用1000 ng/μL濃度的dsIDGF4處理橘小實(shí)蠅3齡幼蟲48 h后，與dsGFP飼喂和水相比，IDGF4沉默率分別為69.2%和73.6%，成活率分別下降29.1%和27.1%，該基因表達(dá)模式的增加可能揭示了其參與熱耐受性，高溫可上調(diào)橘小實(shí)蠅IDGF4的基因表達(dá)，沉默該基因可降低橘小實(shí)蠅在高溫脅迫下的存活率[43]。然而，小胸鱉甲Microdera punctipennis成蟲在4 ℃和-4 ℃不同溫度處理下發(fā)現(xiàn)，-4 ℃在誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶基因（MpCht4、MpCht16、MpCht17、MpCht5-B、MpCht13和MpIDGF2）表達(dá)方面比4 ℃具有更強(qiáng)的效果[44]，表明昆蟲幾丁質(zhì)酶可能具有多種功能，并在昆蟲的冷適應(yīng)中發(fā)揮作用，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4.2 抑制劑

幾丁質(zhì)酶抑制劑能夠特異性地結(jié)合并抑制幾丁質(zhì)酶的活性，使生物正常生長(zhǎng)發(fā)育不能順利進(jìn)行，從而達(dá)到防治病蟲害的效果[45]。目前已研究報(bào)道的幾丁質(zhì)酶抑制劑包括阿洛氨菌素（allosamidin）、精氨芬（argifin）、環(huán)二肽（CI-4）、阿爾加定（argadin）、甲基黃嘌呤（methvlxanthine）類及其衍生物等[46]。其中，阿洛氨菌素是從放線菌Streptomycessp.中分離獲得的一種天然的假三糖，屬糖基類化合物，由一個(gè)allosamizoline 基團(tuán)和兩個(gè)N-乙酰-D-allosamine基團(tuán)組成，是最早最經(jīng)典的Cht抑制劑，可有效地抑制不同來(lái)源的Cht，阻止昆蟲幾丁質(zhì)酶的降解[47,48]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制劑阿洛氨菌素對(duì)幕衣蛾Tineola biselliella幼蟲的致死率很高[49]，說(shuō)明阿洛氨菌素可有效抑制幕衣蛾幾丁質(zhì)酶的降解，影響了該蟲正常的生長(zhǎng)發(fā)育。此外，阿洛氨菌素對(duì)斜紋夜蛾Spodoptera litura幾丁質(zhì)酶的抑制效果是家蠶的3～5倍[50]。這說(shuō)明，阿洛氨菌素對(duì)不同昆蟲幾丁質(zhì)酶的效果也有所差別。

4.3 蛻皮激素

昆蟲20-羥基蛻皮酮（20-hydroxyecdysone，20E），是最活躍的蛻皮激素，其滴度在蛻皮前升高，觸發(fā)與蛻皮相關(guān)基因的表達(dá)，控制和協(xié)調(diào)昆蟲的發(fā)育。蛻皮激素的滴度影響昆蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)代謝過(guò)程中多種酶的表達(dá)及活性。20E可誘導(dǎo)多種昆蟲幾丁質(zhì)酶的表達(dá)。用20E處理黏蟲幼蟲后，不同時(shí)間點(diǎn)MsCht7基因表達(dá)量存在顯著差異，MsCht7基因表達(dá)量在1～24 h隨時(shí)間逐漸升高，24 h時(shí)最高，之后表達(dá)量迅速降低，觀察其生物學(xué)發(fā)現(xiàn)，不同濃度20E處理后5齡幼蟲蛻皮時(shí)間均提前，說(shuō)明黏蟲MsCht7基因表達(dá)量受蛻皮激素調(diào)控[34]。此外，家蠶5齡幼蟲被注射4 μg 20E 6 h后，BmCht5基因表達(dá)量顯著增加，并在8 h時(shí)達(dá)到最大值，而2 μg 20E誘導(dǎo)的BmCht5表達(dá)沒有顯著上調(diào)[51]，蝗蟲LmCht5基因[52]也能受到20E的調(diào)控。與之相類似，20E處理橘小實(shí)蠅幼蟲12 h后，BdCht2、BdCht5、BdCht8、BdCht10和BdCht11的表達(dá)水平顯著上調(diào)，BdCht7、BdIDGF1、BdIDGF2和BdIDGF3的表達(dá)量顯著下調(diào)，表明參與幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的幾丁質(zhì)酶基因受蛻皮激素調(diào)控，至于是直接調(diào)控還是間接調(diào)控，尚需更多的研究結(jié)果回答[29]。

5 昆蟲幾丁質(zhì)酶在害蟲防治方面的應(yīng)用前景

5.1 昆蟲幾丁質(zhì)酶的生物殺蟲劑

一些研究也表明，雖然昆蟲幾丁質(zhì)酶能夠調(diào)控昆蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)的代謝平衡，但當(dāng)其單獨(dú)作用時(shí)殺蟲效果不顯著。如幾丁質(zhì)酶單獨(dú)作用黏蟲和甜菜夜蛾時(shí)，其殺蟲活性不到10%，與空白組沒有顯著差異[53]。研究者認(rèn)為，昆蟲幾丁質(zhì)酶與其他殺蟲劑協(xié)同作用時(shí)能拓寬殺蟲譜，降低單蟲毒素基因產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)，顯著增強(qiáng)殺蟲效果，同時(shí)可以減少殺蟲劑量，降低生態(tài)威脅。如幾丁質(zhì)酶基因Cht36與蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）殺蟲劑協(xié)同對(duì)斜紋夜蛾幼蟲的半致死濃度降低了30%[54]。此外，昆蟲幾丁質(zhì)酶與桿狀病毒協(xié)同作用，能夠提高桿狀病毒的殺蟲能力。Shapiro等[55]研究發(fā)現(xiàn)昆蟲幾丁質(zhì)酶能顯著增強(qiáng)桿狀病毒LdMNPV對(duì)舞毒蛾Lymantria dispar的致死作用，且暴露于NPV-幾丁質(zhì)酶組合的昆蟲比僅攝入NPV的昆蟲死亡得更快。同樣，煙草天蛾幾丁質(zhì)酶的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV），通過(guò)在煙草天蛾幼蟲中的過(guò)表達(dá)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶來(lái)提高殺傷速度[56]。以上研究結(jié)果表明，昆蟲幾丁質(zhì)酶可以影響昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育以達(dá)到害蟲防治目的，具有成為新型高效的生物殺蟲劑的潛力，而且這種的生物殺蟲劑對(duì)環(huán)境友好、人畜無(wú)害，是今后研究與開發(fā)安全、高效生物農(nóng)藥的熱點(diǎn)領(lǐng)域。到目前為止，具有良好殺蟲活性的基因還比較少。因此，幾丁質(zhì)酶也可以用于開發(fā)，從而減少合成農(nóng)藥對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的引入和影響。

5.2 昆蟲幾丁質(zhì)酶在轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用

昆蟲幾丁質(zhì)酶可增強(qiáng)植物對(duì)害蟲的抗性能力。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌和植物的幾丁質(zhì)酶基因?qū)朕D(zhuǎn)基因作物中可增強(qiáng)其對(duì)病原菌的防御能力，但對(duì)害蟲抵御效果不顯著，而將昆蟲幾丁質(zhì)酶基因?qū)胱魑锖螅玫降霓D(zhuǎn)基因作物能高表達(dá)具有生物活性的幾丁質(zhì)酶，可以顯著提高作物的防蟲效果[23]。研究表明，表達(dá)昆蟲幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)昆蟲取食的抗性增強(qiáng)，這是因?yàn)樗軌蚪到庥搔?1,4-n-乙酰氨基葡萄糖組成的幾丁質(zhì)線性聚合物，這是昆蟲角質(zhì)層和PM的重要組成部分。因此，表達(dá)昆蟲幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)基因作物可以免受病原真菌和害蟲的侵害。如海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis中幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)基因玉米植株對(duì)玉米螟Pyraustanubilalis的抗性增加了約50%[57]。引入抗蟲基因的轉(zhuǎn)基因植物為害蟲防治提供了一種有效的替代方法。Ding等[58]將產(chǎn)自煙草天蛾的幾丁質(zhì)酶基因引入煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)綠棉鈴蟲Heliothis virescens幼蟲侵染表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性。煙草天蛾幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)基因番木瓜系在田間條件下對(duì)蜘蛛和螨也表現(xiàn)出顯著的耐受能力[59]。

此外，研究者發(fā)現(xiàn)將昆蟲幾丁質(zhì)酶基因與其他抗蟲基因同時(shí)轉(zhuǎn)入作物中時(shí)，殺蟲活性與單一抗蟲基因相比顯著增強(qiáng)。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將含有昆蟲特異性幾丁質(zhì)酶基因（Chi）和蝎子毒素基因（BmkIT）的新型抗蟲基因組合導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜中，幾丁質(zhì)酶和蝎毒素蛋白均高表達(dá)，對(duì)供試害蟲具有較強(qiáng)的抗性，當(dāng)只有蝎子毒素基因表達(dá)量較高時(shí)，甘藍(lán)型油菜則表現(xiàn)出中等殺蟲活性[60]。Regev等[61]也證實(shí)了 Bt毒素與幾丁質(zhì)酶的協(xié)同作用可以增強(qiáng)對(duì)斜紋夜蛾幼蟲侵染的抗性。因此，昆蟲幾丁質(zhì)代謝關(guān)鍵酶的抗蟲基因組合可作為農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因的新基因來(lái)源之一，是害蟲防控的新思路，有廣闊的應(yīng)用前景。

6 昆蟲幾丁質(zhì)代謝在害蟲防治中的不足與問題

6.1 昆蟲幾丁質(zhì)提取困難

昆蟲幾丁質(zhì)在農(nóng)林[62]、醫(yī)藥[63]、食品[64]等方面具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和廣泛的市場(chǎng)，但昆蟲幾丁質(zhì)的提取面臨著巨大挑戰(zhàn)。目前，缺乏一套高效、環(huán)保、批量提取昆蟲幾丁質(zhì)的工藝流程，因此，今后需要進(jìn)行大量的科學(xué)研究完善昆蟲幾丁質(zhì)的提取工藝。例如，在未經(jīng)處理的幼蟲，甚至包括漂白和干燥的幼蟲，由于其體內(nèi)脂肪含量較高（3%～20%）[65]，幾丁質(zhì)通常不顯示，這一階段的昆蟲細(xì)胞壁具有疏水排斥作用，使用磷酸提取幾丁質(zhì)的效果不顯著。此外，昆蟲細(xì)胞中的色素含量也影響幾丁質(zhì)的提取[66]。研究者發(fā)現(xiàn)，黑色素在蛹期或昆蟲后期能與幾丁質(zhì)共價(jià)結(jié)合，影響使用有機(jī)酸（H3PO4）提取幾丁質(zhì)[67]。所以，開發(fā)新穎、高效的昆蟲幾丁質(zhì)提取技術(shù)已迫在眉睫。

6.2 昆蟲幾丁質(zhì)代謝應(yīng)用的局限性

幾丁質(zhì)降解酶的轉(zhuǎn)基因作物表達(dá)僅能將害蟲中腸圍食膜作為靶點(diǎn)，因此，創(chuàng)建靶向幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)的RNAi-植物保護(hù)劑是害蟲防治的新思路，此方法可將dsRNA傳輸?shù)揭恍├ハx的整個(gè)蟲體內(nèi)，如鞘翅目，使得害蟲整個(gè)蟲體的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)成為靶標(biāo)[68]。這些針對(duì)幾丁質(zhì)代謝途徑的基于RNAi的研究大多數(shù)處于概念驗(yàn)證階段，且并不是所有害蟲和基因?qū)sRNA都會(huì)做出反應(yīng)，因此還需要進(jìn)一步研究克服不同害蟲中RNAi效率的局限性，然后才能被廣泛應(yīng)用[69,70]。此外，昆蟲幾丁質(zhì)酶雖已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物，但在一些轉(zhuǎn)基因植物中幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)錄水平低，易被降解，并對(duì)非靶標(biāo)生物存在副作用等問題[71]。而且，除昆蟲幾丁質(zhì)酶之外，其他昆蟲幾丁質(zhì)代謝關(guān)鍵酶在轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用研究實(shí)例較少。但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，昆蟲幾丁質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶基因會(huì)更加廣泛地應(yīng)用在植物保護(hù)領(lǐng)域。

7 小結(jié)與展望

昆蟲幾丁質(zhì)酶能夠干擾昆蟲的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)，消化昆蟲營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)和外骨骼中的幾丁質(zhì)，這對(duì)昆蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和生存至關(guān)重要，在害蟲防治方面具有特別的效果。就目前研究而言，通過(guò)體外合成dsRNA，并經(jīng)飼喂或注射方式使害蟲幼蟲攝取，破壞昆蟲幾丁質(zhì)代謝平衡，干擾相應(yīng)幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)，導(dǎo)致害蟲蛻皮困難、翅發(fā)育畸形，甚至死亡，是一種潛在的生物殺蟲途徑[72]。幾丁質(zhì)酶在害蟲防治方面的應(yīng)用前景主要體現(xiàn)在兩方面，一是昆蟲幾丁質(zhì)酶可作為生物殺蟲劑備受人們的關(guān)注，當(dāng)昆蟲幾丁質(zhì)酶與其他殺蟲劑協(xié)同作用時(shí)殺蟲效果更加。然而，目前研究發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶調(diào)控害蟲的機(jī)制復(fù)雜多樣，且其活性受多種因素影響，因此實(shí)踐研究尚未廣泛開展，還需要進(jìn)一步探索；二是昆蟲幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)基因作物具有很好的抗蟲效果，所以，昆蟲幾丁質(zhì)代謝關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)基因作物將是害蟲防控的新思路，有較為廣闊的應(yīng)用前景。

綜上所述，針對(duì)昆蟲幾丁質(zhì)合成和降解酶開發(fā)的用于害蟲防治藥物，在植物保護(hù)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。探索昆蟲幾丁質(zhì)酶對(duì)昆蟲的調(diào)控機(jī)制可能為設(shè)計(jì)既對(duì)環(huán)境無(wú)害又對(duì)害蟲高效的新型殺蟲劑提供機(jī)會(huì)，為害蟲防治提供新的策略和思路[73]。