李 婷，張淑臣，申曉鴻，師光祿，劉京國*

(北京農(nóng)學(xué)院a.植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，b.生物科學(xué)與工程學(xué)院/農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

Vip3A毒素是一種由蘇云金芽孢桿菌在對(duì)數(shù)生長期產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外的蛋白。它對(duì)多種鱗翅目害蟲具有殺蟲活性，并且對(duì)小地老虎(Agrotisypsilon)、草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)等對(duì)Cry1A毒素不敏感的害蟲具有較高的殺蟲活性[1,2]。由于Vip3A毒素與Cry1A毒素之間沒有氨基酸序列同源性，不存在競爭結(jié)合敏感昆蟲上的受體蛋白，它們的殺蟲機(jī)理不同[1,3-7]。將Vip3A毒素和Cry1A毒素聯(lián)合使用，既能擴(kuò)大Cry1A毒素的殺蟲譜，又能延緩敏感昆蟲對(duì)Cry1A毒素抗性的產(chǎn)生。

攝入Vip3A前毒素后，昆蟲中腸內(nèi)的蛋白酶會(huì)將Vip3A毒素活化。Vip3A活化后產(chǎn)生62 kDa的大片段和22 kDa的小片段，而且這兩個(gè)片段依然結(jié)合在一起[8,9]?；罨蟮腣ip3A能在體外形成四聚體，并在BBMVs(Brush Border Membrane Vesicles)上形成孔道，而且這種孔道的形成是pH依賴性的[9,10]。與Cry毒素在高pH條件下形成孔道不同，Vip3A在pH8.0時(shí)，孔道活性最大，在pH10.0時(shí)則沒有活性[10]。在體外試驗(yàn)中，Vip3A前毒素既能被敏感昆蟲中腸汁液和胰蛋白酶活化，又能被非敏感昆蟲中腸汁液活化[3,11]，但是不同昆蟲中腸汁液對(duì)Vip3A的活化速率是不同的[11-13]。活化對(duì)于Vip3A毒素發(fā)揮殺蟲活性是必須的，因?yàn)橹挥谢罨腣ip3A毒素能在敏感昆蟲BBMVs上形成孔道，而前毒素則不能[3]。并且活化的Vip3A只能在敏感昆蟲中腸BBMVs上形成孔道，而不能在非敏感昆蟲中腸BBMVs上形成孔道[3]，這表明，活化后的Vip3A與BBMVs的結(jié)合是發(fā)揮其殺蟲活性的關(guān)鍵步驟。毒理試驗(yàn)結(jié)果顯示，Vip3A與BBMVs上的蛋白結(jié)合后，會(huì)引起中腸上的杯狀細(xì)胞和柱狀細(xì)胞與基底膜脫離、破碎[14]；Vip3A處理敏感昆蟲后會(huì)引起上皮細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致昆蟲死亡[15，16]。

盡管Vip3A與敏感昆蟲中腸上蛋白的結(jié)合是發(fā)揮殺蟲活性的關(guān)鍵，但是目前尚未確定中腸上皮細(xì)胞上哪些蛋白參與Vip3A的殺蟲過程。配體印跡試驗(yàn)結(jié)果顯示，Vip3A毒素在煙草天蛾BBMVs上能結(jié)合分子量分別為80 kDa和100 kDa的蛋白[3]，在灰翅夜蛾(Spodopteramauritia)BBMVs上能結(jié)合分子量分別為55 kDa 和100 kDa 的蛋白[4]。遺憾的是，這些蛋白還未得到鑒定。

在本文中，利用制備的Vip3Aa10前毒素和活化的毒素，分析它們對(duì)甜菜夜蛾的殺蟲活性，與BBMVs的結(jié)合特性以及在BBMVs上的結(jié)合蛋白。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)中所用的含pET28a-Vip3Aa10的E.coli(λDE3)菌株為實(shí)驗(yàn)室原有。甜菜夜蛾購買于河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司，Protease Inhibitor Cocktail Tablets購自Roche公司，Ni Sepharose購自GE公司，化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自北京全式金生物有限公司，其他所用常規(guī)試劑購自北京暢華科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Vip3Aa10蛋白的表達(dá)純化和活化 將含pET28a-Vip3Aa10的E.coli(λDE3)接種到20 mL含Kan的LB培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min培養(yǎng)過夜，第2天轉(zhuǎn)接到1 L含Kan的 LB培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min培養(yǎng)，待OD600nm達(dá)到0.6左右時(shí)，加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG，在25℃，110 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)6 h，離心收集菌體。用裂解緩沖液(25 mmol/L Tris-Cl，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L β-巰基乙醇，pH8.0)懸浮菌體，加入溶菌酶、PMSF 和終濃度為1% Triton X-100，冰浴攪拌至溶液變黏稠，超聲破碎后，補(bǔ)加PMSF，然后4℃ 15 000 r/min 離心20 min，上清與用裂解液預(yù)平衡的瓊脂糖凝膠Ni 在4℃混合30 min，然后用含50 mmol/L咪唑的高鹽緩沖液(25 mmol/L Tris-Cl，1 000 mmol/L NaCl，5 mmol/L β-巰基乙醇，pH8.0)洗滌3個(gè)柱體積。最后用含高濃度咪唑的洗脫緩沖液(25mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L β-巰基乙醇，pH8.0)洗脫目的蛋白。親和層析提取后的目的蛋白再用離子交換層析純化，用NaCl濃度梯度洗脫。收集目標(biāo)蛋白組分，并用洗脫緩沖液透析，然后用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白。

分別用0.01%、0.10%、1.00%、10.00%、25.00%、100.00%的胰蛋白酶(wt/wt)在37℃活化10 μg Vip3Aa10蛋白1 h，加入終濃度為4 mmol/L AEBSF室溫放置10 min，終止反應(yīng)，然后加入上樣緩沖液，煮沸5 min，SDS-PAGE電泳檢測。

用2%胰蛋白酶(wt/wt)大量處理Vip3Aa10，然后用離子交換層析純化，用NaCl濃度梯度洗脫。收集目標(biāo)蛋白組分，用洗脫緩沖液透析，然后用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。

1.2.2 甜菜夜蛾BBMVs的制備 取4-5齡幼蟲放于冰上15 min，縱向解剖，取出中腸并清除中腸內(nèi)容物，然后用預(yù)冷的0.9% NaCl清洗中腸，吸干水稱重，-80℃保存?zhèn)溆?。取大約1 g中腸，加9倍體積的緩沖液A(17 mmol/L Tris-Cl，300 mmol/L Mannitol，5 mmol/L EDTA，pH 8.0)和1片蛋白酶抑制劑，用勻漿器充分勻漿。向勻漿液中加入等體積的24 mmol/L MgCl2，充分混勻，于冰浴中靜置15 min，然后4℃，3 000 r/min 離心15 min，棄沉淀，上清進(jìn)一步離心，30 000 r/min，30 min，4℃，棄上清，沉淀用緩沖液B(25 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，pH 8.0)懸浮。測定濃度后在-80℃保存。

1.2.3 Vip3A蛋白與甜菜夜蛾BBMVs的結(jié)合 用170 μL不同pH的緩沖液分別與25 μg甜菜夜蛾BBMVs或黃粉蟲BBMVs混勻，然后依次加入20 μL蛋白酶抑制劑和2 μg Vip3Aa10-T，室溫孵育1 h后，30 000 r/min，4℃，離心30 min，用200 μL 緩沖液洗滌2次，沉淀用上樣緩沖液懸浮，煮沸5 min。

用2%胰蛋白酶(wt/wt)在37℃處理Vip3Aa10 1 h。用170 μL緩沖液(50 mmol/L Na2CO3，100 mmol/L NaCl，0.2% β-ME，pH 9.0)與25 μg甜菜夜蛾BBMVs混勻，再與2 μg活化的Vip3Aa10(總體積為200 μL)在室溫孵育1 h后，30 000 r/min，4℃，離心30 min；用200 μL緩沖液洗滌2次，沉淀用上樣緩沖液懸浮，煮沸5 min。

樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。先用脫脂奶粉封閉過夜，然后依次與Vip3Aa10的抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體孵育，最后用化學(xué)發(fā)光法檢測。

1.2.4 Vip3Aa10-T蛋白在甜菜夜蛾BBMVs上的結(jié)合蛋白 將1 mg Vip3Aa10-T(1mg/ml)在pH8.0碳酸鈉緩沖液中透析后，與32 μL 10 mmol/L的NHS-biotion混勻，冰浴標(biāo)記2 h，然后用PBS透析，測濃度后于-20℃保存。

取40 μg 甜菜夜蛾BBMVs與上樣緩沖液混勻，煮沸5 min，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。先用牛血清白蛋白封閉2 h，然后依次與生物素標(biāo)記的Vip3Aa10-T、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素孵育，最后用化學(xué)發(fā)光法檢測。

1.2.5 生物活性測定 制備甜菜夜蛾人工飼料，分裝于24孔板中。用PBS稀釋蛋白至0.04、0.20、1.00和5.00 μg/mL。然后將不同濃度的蛋白加在飼料表面，每個(gè)孔100 μL，每個(gè)蛋白濃度做3組孔板，晾干。將剛孵化出的一齡幼蟲放入24孔板中，每孔一頭，7 d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，用SPSS軟件計(jì)算出LC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 Vip3Aa10的制備與活化

在構(gòu)建pET28a-Vip3Aa10質(zhì)粒時(shí)，Vip3Aa10的N端融合His×6標(biāo)簽，在E.coli中表達(dá)的Vip3Aa10可以用親和純化的方法制備，然后用離子交換層析進(jìn)一步純化，得到分子量為90 kDa的His-Vip3Aa10(圖1A)。

為了優(yōu)化制備活化的Vip3Aa10的條件，用不同濃度的胰蛋白酶處理Vip3Aa10，隨著胰蛋白酶濃度的升高，90 kDa的His-Vip3Aa10逐漸減少，62 kDa的片段逐漸增多。在1%(wt/wt)胰蛋白酶濃度下，His-Vip3Aa10基本活化成62 kDa的片段(圖1B)。為保證Vip3Aa10活化完全，后續(xù)用2%(wt/wt)的胰蛋白酶處理Vip3Aa10，并用離子交換層析進(jìn)一步純化，得到活化的Vip3Aa10(圖1C泳道2)。

2.2 Vip3Aa10對(duì)甜菜夜蛾殺蟲活性測定

活化的Vip3A的殺蟲活性高于Vip3Aa前毒素[17]。盡管活化的Vip3Aa10對(duì)甜菜夜蛾的LC50要低于Vip3Aa10前毒素，但是，若考慮置信區(qū)間，兩者的殺蟲活性沒有顯著變化。同時(shí)，這也說明，活化的Vip3Aa10與Vip3Aa10前毒素對(duì)甜菜夜蛾同樣具有殺蟲活性(表1)。

表1活化的Vip3Aa10與Vip3Aa10前毒素對(duì)甜菜夜蛾的殺蟲活性

Tab.1ThetoxicityofactivatedVip3Aa10andVip3Aa10protoxinsagainstS.exigua

毒素toxinsLC50/(ng·cm-2)95%置信區(qū)間/(ng·cm-2)95% Fiducial limitHis-Vip3Aa1013.3599.447～17.853Activated Vip3Aa106.0952.336～10.179

2.3 Vip3Aa10與甜菜夜蛾BBMVs的結(jié)合

活化的Vip3A只能結(jié)合敏感昆蟲中腸BBMVs。為了驗(yàn)證活化的Vip3Aa10能否與甜菜夜蛾中腸BBMVs結(jié)合，先用2%(wt/wt)胰蛋白酶處理Vip3Aa10，然后與甜菜夜蛾中腸BBMVs共育，用免疫印跡檢測Vip3Aa10。盡管SDS-PAGE電泳后檢測不到胰蛋白酶處理后的Vip3Aa10前毒素(圖1B)，但是免疫印跡結(jié)果顯示，仍有小部分Vip3Aa10前毒素沒有被完全活化(圖2A泳道3)。從泳道4中可以看出，活化后的62 kDa Vip3Aa10能與甜菜夜蛾BBMVs結(jié)合(圖2A)。泳道4中Vip3Aa10前毒素與活化后的Vip3Aa10的比例顯著高于泳道3，這說明，Vip3Aa10前毒素比活化的毒素更容易與BBMVs結(jié)合。

注：A為Vip3Aa10經(jīng)親和層析和離子交換層析的結(jié)果。泳道1-9為離子交換層析時(shí)用不同NaCl濃度梯度洗脫的目的蛋白。B為Vip3Aa10蛋白的活化。泳道1為Vip3A蛋白；泳道2-7分別用0.01%、0.10%、1.00%、10.00%、25.00%、100.00%的胰蛋白酶(wt/wt)在37℃活化Vip3Aa10 1 h，然后加入AEBSF，室溫放置10 min終止反應(yīng)，SDS-PAGE電泳檢測。C為純化后Vip3Aa10和活化的Vip3Aa10。泳道1為Vip3Aa10蛋白；泳道2為活化的Vip3Aa10蛋白。M為低分子量蛋白marker。Note:A-The purification of Vip3Aa10 by affinity chromatography and ion exchange chromatography. Lanes 1-9: target proteins eluted with different concentration gradients of NaCl during ion exchange chromatography. B-The activation of Vip3Aa10 protein. Lane 1: Vip3A protoxin; lanes 2-7: Vip3Aa10 were activated by 0.01%, 0.10%, 1.00%, 10.00%, 25.00%, 100.00% trypsin (wt/wt) at 37℃ for 1 h, respectively, followed by stopping the reaction with AEBSF at room temperature for 10min and SDS-PAGE. C-The preparation of Vip3Aa10 and activated Vip3Aa10. Lane 1: Vip3Aa10 protein; lane 2: Activated Vip3Aa10. M: low molecular weight protein marker.圖1 Vip3Aa10的制備與活化Fig.1 The preparation and activation of Vip3Aa10

鱗翅目昆蟲的中腸環(huán)境為中性偏堿性，Cry1A毒素在堿性條件下更容易與BBMVs結(jié)合并形成寡聚體[18]。為了分析pH對(duì)Vip3Aa10-T與BBMVs結(jié)合的影響，將Vip3Aa10-T在不同的pH條件下與BBMVs結(jié)合。Vip3Aa10-T蛋白在pH8.0～10.0的條件下都能與甜菜夜蛾的BBMVs結(jié)合，但是在pH8.0時(shí)結(jié)合量最多，隨著pH的升高而逐漸降低(圖2B)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Vip3A與BBMVs的結(jié)合是否有物種特異性，將Vip3Aa10-T在pH8.0和10.0條件下分別與甜菜夜蛾和黃粉蟲BBMVs結(jié)合。免疫印跡結(jié)果顯示，活化的Vip3Aa10與甜菜夜蛾和黃粉蟲BBMVs都能結(jié)合。而且，都是在pH8.0時(shí)的結(jié)合量高于pH10.0(圖2C)。

2.4 Vip3Aa10在甜菜夜蛾BBMVs上的結(jié)合蛋白

為了檢測Vip3Aa10在甜菜夜蛾BBMVs上的結(jié)合蛋白，先將甜菜夜蛾BBMVs經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再依次與生物素標(biāo)記的Vip3Aa10-T和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉親和素孵育，最后用化學(xué)發(fā)光法檢測。生物素標(biāo)記的Vip3Aa10-T在甜菜夜蛾BBMsV上有4條結(jié)合蛋白，其分子量分別為80、38、31和22 kDa(圖3)。

注：A為Vip3Aa10蛋白與甜菜夜蛾BBMVs的結(jié)合。泳道1為甜菜夜蛾BBMVs；泳道2為Vip3Aa10前毒素；泳道3為活化后的Vip3Aa10；泳道4為活化的Vip3Aa10與甜菜夜蛾BBMVs結(jié)合。B為不同pH條件下Vip3Aa10-T蛋白與甜菜夜蛾BBMVs的結(jié)合。泳道1為甜菜夜蛾BBMVs；泳道2為Vip3Aa10-T蛋白；泳道3-5分別為在pH 8.0、9.0和10.0條件下Vip3Aa10-T蛋白與甜菜夜蛾BBMVs結(jié)合。C為活化的Vip3Aa10蛋白與甜菜夜蛾和黃粉蟲BBMVs的結(jié)合。泳道1為甜菜夜蛾BBMVs；泳道2為黃粉蟲BBMVs；泳道3為Vip3Aa10-T蛋白；泳道4和6分別為Vip3Aa10-T蛋白在pH8.0和10.0條件下與甜菜夜蛾BBMVs結(jié)合；泳道5和7分別為Vip3Aa10-T蛋白在pH8.0和10.0條件下與黃粉蟲BBMVs結(jié)合。M為低分子量蛋白marker。Note:A-The binding of Vip3Aa10 protein to S. exigua BBMVs. Lane 1: S. exigua BBMVs; lane 2: Vip3Aa10 protoxin; lane 3: activated Vip3Aa10; lane 4: activated Vip3Aa10 bound to S. exigua BBMVs. B-The binding of Vip3Aa10-T protein to S. exigua BBMVs under different pH conditions. Lane 1: S. exigua BBMVs; lane 2: Vip3Aa10-T protein; lanes 3-5: the binding of Vip3Aa10-T protein to S. exigua BBMVs at pH 8.0, 9.0 and 10.0, respectively. C-The binding of the activated Vip3Aa10 protein to S. exigua and T. molitor BBMVs. Lane 1: S. exigua BBMVs; lane 2: T. molitor BBMVs; lane 3: Vip3Aa10-T protein; lanes 4 and 6: Vip3Aa10-T proteins bound to S. exigua BBMVs at pH 8.0 and 10.0, respectively; lanes 5 and 7: Vip3Aa10-T protein bound to T. molitor BBMVs at pH 8.0 and 10.0, respectively. M: low molecular weight protein marker.圖2 Vip3Aa10蛋白與甜菜夜蛾BBMV的結(jié)合Fig.2 The binding of Vip3Aa10 protein to S. exigua BBMVs

注：泳道1為甜菜夜蛾BBMVs，M為低分子量蛋白Marker。Note:Lane 1: S. exigua BBMVs, M: low molecular weight protein marker.圖3 配體印跡法檢測Vip3Aa10在甜菜夜蛾上的結(jié)合蛋白Fig.3 The Vip3Aa10 binding-protein on S. exigua BBMVs determined by ligand blot

3 討 論

Vip3A毒素的殺蟲過程與Cry毒素類似，都是經(jīng)歷昆蟲攝入、被昆蟲中腸內(nèi)的蛋白酶活化、與昆蟲中腸上皮細(xì)胞上的受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2]。Vip3A可被敏感昆蟲中腸汁液和胰蛋白酶活化得到的62、43、33和22 kDa的蛋白[3]。這4條帶的產(chǎn)生是由于在上樣緩沖液中62 kDa的片段被胰蛋白酶進(jìn)一步降解成43和33 kDa的條帶。因?yàn)樵诜磻?yīng)結(jié)束后加入上樣緩沖液，緩沖液中的SDS能將Vip3A變性，而不能將胰蛋白酶失活。若用AEBSF終止反應(yīng)，這種現(xiàn)象就會(huì)消失，只剩下62和22 kDa的條帶[8]。在圖1B中，除62和22 kDa的條帶外，33 kDa的條帶依然存在。

鱗翅目昆蟲的中腸環(huán)境是中性偏堿性。隨著溶液的堿性越來越強(qiáng)，Cry1A毒素更容易與BBMVs結(jié)合并形成寡聚體[18]。在圖2B和圖2C中，活化的Vip3Aa10在pH8.0時(shí)與BBMVs的結(jié)合最強(qiáng)。Vip3A在不同pH溶液中的形狀是不同的[19]，這些現(xiàn)象解釋為什么在pH8.0時(shí)活化的Vip3Aa10更容易在BBMVs上形成孔道[10]。此外，活化后的Vip3A能與BBMVs結(jié)合。在圖2A中，Vip3Aa10前毒素比活化后的毒素更容易與甜菜夜蛾BBMVs結(jié)合。因?yàn)楫?dāng)用2%(wt/wt)胰蛋白酶活化Vip3Aa10前毒素時(shí)，用SDS-PAGE檢測時(shí)，看不到Vip3Aa10前毒素，只能看到62 kDa的活化毒素。當(dāng)用免疫印跡檢測時(shí)，卻能看到這條帶。而且，在胰蛋白酶處理后的溶液中，Vip3Aa10前毒素與Vip3Aa10-T的亮度比約1∶3，但是當(dāng)與BBMVs孵育后，結(jié)合到BBMVs上的Vip3Aa10前毒素與Vip3Aa10-T的亮度比約1∶1。當(dāng)用生物素標(biāo)記的Vip3Aa10前毒素與BBMVs結(jié)合時(shí)，基本檢測不到條帶(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

Vip3A與敏感昆蟲中腸上皮細(xì)胞上的受體結(jié)合是其發(fā)揮殺蟲活性的關(guān)鍵。Vip3A毒素在煙草天蛾BBMV上能結(jié)合分子量分別為80 kDa和100 kDa蛋白[3]，在灰翅夜蛾BBMV上能結(jié)合分子量分別為55 kDa 和100 kDa 的蛋白[4]。Vip3Aa10在甜菜夜蛾上的結(jié)合蛋白有4條，其分子量分別為80、38、31和22 kDa。盡管在圖3中，除這4條帶外，還有其他的條帶，但是當(dāng)顯色時(shí)間短時(shí)，其他的條帶看不到。這說明Vip3Aa-T與這4條蛋白的結(jié)合能力是較強(qiáng)的，也較有可能是Vip3a的受體蛋白。這為后續(xù)鑒定Vip3A的受體奠定基礎(chǔ)。