余 麗，劉旭倩

(西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院 西南醫(yī)科大學口腔頜面部重建與再生實驗室，四川 瀘州 646000)

隨著社會的發(fā)展和生活方式的改變，由創(chuàng)傷、疾病等造成的骨退行性疾病的發(fā)病率急速升高[1]，在骨再生修復中，對于生物相容性良好的人造骨的應用需求也迅速增加。目前，針對骨退行性疾病的治療方案主要包括自體骨移植、同種異體骨移植、人造骨移植和骨組織工程(bone tissue engineering，BTE)技術。自體骨移植是骨誘導和骨形成的理想方式，但需要二次手術，且供體部位可能出現(xiàn)炎癥反應；而同種異體骨移植可能會發(fā)生疾病傳播和免疫反應[2]。目前，人造骨移植技術雖然是臨床常用的替代治療方法，并取得了顯著效果，但對于機體來說，該方法是無生命異物的植入，與機體功能可能不符。組織工程骨的主要優(yōu)勢在于其自體細胞來源的低感染性和低致癌率。BTE的3大要素為支架材料、種子細胞和細胞因子[3-5]，BTE在3大要素共同作用下實現(xiàn)人體受損組織器官的修復和功能重建[6]。膠原蛋白是動物細胞合成的一種生物大分子蛋白質(zhì)，相對分子量為97 000 000，在骨的有機質(zhì)中達90%以上，膠原蛋白在骨損傷后的再生修復中起決定性作用，膠原蛋白作為支架材料為組織再生提供模板，為種子細胞提供一定的生長環(huán)境，對細胞的黏附、生長、遷移和分化過程產(chǎn)生重要影響，并引導新生骨組織形成[7-9]。由于膠原蛋白力學性能差，在含水時難以塑形，無法支撐組織重建，導致支架崩解；同時，膠原蛋白降解速度快、有病毒傳播風險的缺點，限制了其在組織工程中的應用[10]。類人膠原蛋白(human-like collagen，HLC)是將動物來源的膠原蛋白mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)酶切后的一段基因重組于大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)內(nèi)，經(jīng)過高密度發(fā)酵、分離、復性等工藝形成的高分子生物蛋白[11]。相比膠原蛋白，HLC具有更好的生物相容性、水溶性、可加工性、低免疫原性，且無病毒傳播風險[12]，該材料已成功應用于血管支架[13-16]、人造骨[11，17-18]和皮膚組織[19]。本文對HLC在BTE中作為支架材料參與骨組織再生修復的應用進展進行綜述。

1 理想BTE支架材料的特點

理想的BTE支架材料主要包含以下幾個特點：(1)良好的生物相容性：可促進細胞黏附、增殖和分化，促生長因子形成，為組織再生提供最佳的生長環(huán)境[20]；(2)低免疫原性：支架材料在植入人體后不出現(xiàn)排斥反應，植入部位無炎癥表現(xiàn)[12]；(3)理想的孔隙率：理想的支架材料為細胞生長提供合適的孔隙[7]，支架材料的多孔結(jié)構可促進細胞與新宿主組織之間的浸潤性和生物活性交換，以誘導新骨形成；(4)良好的生物降解性[21]：支架材料及其降解產(chǎn)物均無細胞毒性，且降解速度與細胞增殖速度匹配[12]；(5)無病毒傳播風險[22]；(6)具有3D支架空間結(jié)構，為細胞生長提供結(jié)構支撐和模板[7]；(7)骨生成、骨傳導和骨誘導性[23-24]。植入材料提供一種生物刺激，通過整合宿主骨與移植材料而促進成骨細胞的黏附和生長，引導骨形成。BTE通過模擬骨修復的自然過程，在預期骨修復部位調(diào)控成骨細胞、生物支架、生物活性物質(zhì)等來促進新骨形成，從而使新骨組織發(fā)揮機械運動和維持新陳代謝的作用[1]。

2 HLC在BTE中的優(yōu)勢、局限性及解決策略

2.1HLC在BTE中的優(yōu)勢

2.1.1良好的生物相容性HLC植入人體后不出現(xiàn)炎癥反應，能耐受人體各系統(tǒng)的作用而保持相對穩(wěn)定，為細胞的生長提供良好的微環(huán)境，且無毒、不致畸，能安全用于人體[25]；此外，HLC的酸堿度值為6.5～7.5，呈中性，不會破壞人體的酸堿平衡。

2.1.2可加工性HLC通過疏水鍵折疊組裝成三螺旋結(jié)構，膠原分子鍵相互聚合成網(wǎng)狀，形成富有彈性、機械性能良好的骨架結(jié)構；由于HLC的熱降解溫度始于250 ℃[2]，故HLC具有分子量和生物特性保持不變的可加工性[26]。

2.1.3理想的孔隙率和孔徑研究表明，支架材料的孔隙率是組織再生的關鍵因素，而支架材料的多孔結(jié)構為細胞提供生長的微環(huán)境；孔徑太小會導致營養(yǎng)物質(zhì)、代謝廢物的輸送障礙；而孔徑太大可影響支架材料的結(jié)構和機械性能，減小黏附在支架上的細胞數(shù)量，導致骨修復不理想[11，27]。

2.1.4水溶性HLC是由重組技術產(chǎn)生的水溶性蛋白，與其他生物材料結(jié)合時具有良好的潤濕性和滲透性，可促進細胞黏附。有研究表明，有機溶劑處理生物材料需要1 a或更長時間才能完全吸收，而水溶性支架材料吸收時間一般不超過6個月[28]。

2.1.5無病毒傳播隱患生物材料的蛋白活性成分是通過基因工程實現(xiàn)的，常被內(nèi)毒素污染[29]；而HLC是反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，經(jīng)酶切后重組于E.coli內(nèi)，經(jīng)過發(fā)酵、分離、復性、純化工藝形成的高分子生物蛋白，彌補了膠原蛋白病毒隱患的缺點。

2.1.6低免疫原性HLC是由膠原蛋白(已知序列膠原蛋白部分基因)經(jīng)基因篩選及修飾后構建的，摒棄了容易引起免疫反應的色氨酸等氨基酸殘基并進行特定的序列重復，因此，在進入人體后其免疫排異反應大大減少[22]。

2.2HLC在BTE中的局限性及解決策略

2.2.1低生物力學強度HLC的生物力學強度較低，基于HLC修復的新骨機械強度較差，容易產(chǎn)生骨愈合不良甚至二次骨折；在骨再生修復中，植入物的生物力學強度應與周圍組織的機械強度相匹配[30]，以使植入物在進入受植部位后能夠與周圍組織形成良好的骨整合，保證骨發(fā)揮其正常的支持、運動、負重等功能。ZHENG等[31]研究發(fā)現(xiàn)，以HLC作為有機相，以羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAp)為無機相，天然的京尼平作為交聯(lián)劑，通過水熱法制備新型生物可降解HLC/HAp多孔骨支架材料，且細胞學和生物力學實驗表明，以HLC為基礎的支架材料具有良好的生物力學強度、可控的生物降解速度和親水性。

2.2.2不可控的生物降解速度骨修復材料置入后需要有可控的生物降解速度[32]；生物材料逐漸降解的同時，成骨細胞不斷增殖，從而達到修復骨缺損的目的。在實際應用中，HLC常聯(lián)合其他天然生物材料、人工合成高分子材料等用于骨再生修復，使HLC在保證自身生物特性不變的情況下實現(xiàn)可控的生物降解速度。微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase，MTGase)是一種在溫和條件下具有高比活性和反應速率的無毒交聯(lián)劑，ZHAO等[33]研究發(fā)現(xiàn)，HLC可通過與MTGase交聯(lián)產(chǎn)生MTGase/HLC(MTGH)水凝膠支架，且MTGase以濃度依賴方式參與MTGH水凝膠支架的降解行為，而體外細胞黏附和生物相容性的實驗結(jié)果表明，40 U·g-1MTGase制備的MTGH水凝膠支架更適合細胞黏附并具有最低的毒性。

3 HLC聯(lián)合其他生物材料用于骨組織再生修復的現(xiàn)狀

3.1HLC聯(lián)合納米羥基磷灰石(nano-hydroxya-patite，n-HAp)修復骨缺損n-HAp是人體骨天然的主要組成部分，是引導骨再生修復的理想生物材料；交聯(lián)技術可以增加支架的機械強度，化學交聯(lián)劑如碳化二亞胺或戊二醛的高細胞毒性影響了支架材料的生物相容性[34-35]，因此，需要使用天然無細胞毒性的交聯(lián)劑，橄欖苦苷即是其中一種。橄欖苦苷抗氧化能力強，可減少自由基產(chǎn)生，有助于骨吸收和誘導骨形成，對骨質(zhì)流失起保護作用。有研究顯示，橄欖苦苷可預防大鼠炎癥性骨質(zhì)減少[36]。FAN等[2]通過橄欖苦苷交聯(lián)制造的HLC/n-HAp復合支架保留了HLC的生物學特性和n-HAp的力學性能和骨傳導性，與未交聯(lián)的支架材料相比，復合支架具有良好的機械性能，同時可增強細胞的黏附和增殖。

3.2HLC聯(lián)合n-HAp和聚乳酸修復骨缺損呂玉明等[18]在研究由自體內(nèi)皮細胞、成骨細胞和新型生物可吸收n-HAp/重組類人膠原蛋白(recombinant human-like collagen，RHLC)/聚乳酸(polylactic acid，PLA)(n-HAp/RHLC/PLA)組成的組織工程支架材料增強犬的骨再生和修復股骨頭缺損實驗中發(fā)現(xiàn)，n-HAp/RHLC/PLA支架材料組骨缺損區(qū)在骨修復后3個月時可見缺損區(qū)基底部有大量類骨質(zhì)和新生骨小梁形成，在骨小梁邊緣存在較多的成骨細胞，修復區(qū)血管豐富，成骨反應由基底向中心部推進；6個月時充填區(qū)骨小梁成熟明顯，可見有編織骨形成；缺損區(qū)中央偶見碎裂的支架材料；新骨形成量和成骨細胞數(shù)由基底部向外周遞減，骨小梁的成熟度也由基底向外周遞減，且隨著新骨形成，n-HAp/RHLC/PLA 支架逐漸降解吸收；而對照組新生骨組織形成較少。ZHOU等[24]研究表明，n-HAp/RHLC/PLA支架材料是骨再生的理想生物支架材料。

4 小結(jié)

骨是人體器官的重要組成部分，探索組織相容性良好的骨修復材料對骨組織工程研究具有重要意義。HLC具有良好的生物相容性，可以安全用于人體，尚未發(fā)現(xiàn)有術后免疫反應的報道。目前，HLC支架材料已成功用于血管支架[13-16]、人造骨[11，17]和皮膚組織[19]等醫(yī)學組織工程領域。然而，由于HLC較低的生物力學強度和不可控的降解速度，研究者們常將HLC聯(lián)合其他生物材料制備組織工程生物支架，如HLC/n-HAp 支架材料、HLC/殼聚糖支架材料等，這些支架材料在保留了HLC良好的生物學特性的基礎上，又克服了HLC生物力學強度低和降解速度不可控的缺點。雖然通過反轉(zhuǎn)錄方式獲得的HLC支架材料在骨再生修復研究中取得了一些進展，但還有很多問題亟須解決，如在大面積骨缺損的環(huán)境下HLC如何有效實現(xiàn)骨的缺損修復與功能重建、HLC支架材料能否應用于更廣泛的醫(yī)學領域等。相信隨著醫(yī)學科學技術水平的提高和研究者對基因重組蛋白的進一步認識，以HLC為基礎合成的復合型骨支架材料必將成為骨再生修復的應用熱點，為組織工程新型支架材料的研究和開發(fā)提供新方法、新方向。