陳永亮 ，舒 東 ，陶銀利 ，謝小林 ，陶 靜 ，劉 杰 ，袁 櫻 ，劉 瓊 ，譚長現(xiàn) ，施汀蘭

（1.重慶市忠縣中醫(yī)醫(yī)院，重慶 404300； 2.重慶市中藥研究院，重慶 400065）

三伏藥貼源于宋代王執(zhí)中《針灸資生經(jīng)》最早提到的“天灸”，即用旱蓮草外敷治瘧，用藥后皮膚局部起泡如灸皰，今稱藥物發(fā)皰灸。清代張璐《張氏醫(yī)通》中采用白芥子、細(xì)辛、延胡索、甘遂共為末，入麝香，調(diào)敷肺俞、膏肓、百勞等穴治哮喘。本研究中采用的三伏三九貼是在張氏方基礎(chǔ)上加減應(yīng)用，通過以膚固表、以表托里、以經(jīng)通臟、以穴驅(qū)邪，達(dá)到扶正強(qiáng)身的目的，適用于哮喘、咳嗽、慢性支氣管炎疾病的治療。本研究中通過動物實(shí)驗(yàn)，探討三伏三九貼止咳、祛痰及平喘的藥理作用，為臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。

1 動物、試藥與儀器

動物：SPF級KM小鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g；SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g；普通級Hartley豚鼠，160只，雌雄各半，其中80只體質(zhì)量為150～200 g，其余80只為250～300 g。以上實(shí)驗(yàn)動物均由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2012-0006，動物使用許可證號：SYXK（渝）2012-0003。所用動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

試藥：三伏三九貼（重慶市忠縣中醫(yī)醫(yī)院，批號為20170714）；咳特靈膠囊（廣東羅浮山國藥股份有限公司，批號為L17B022）；氨水（重慶川東化工＜集團(tuán)＞有限公司，批號為20140401）；烏拉坦（成都市科龍化工試劑廠，批號為2015032701）；磷酸組胺（西亞試劑，批號為M3639）；卵清蛋白（OVA，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號為080M1705V）。

儀器：UW-4200S型電子天平（島津國際貿(mào)易有限公司）；BSA3202S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司)；YLS-8A型多功能誘咳引喘儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 穴位選擇

考慮到臨床使用和實(shí)驗(yàn)的可操作性，選取小鼠、大鼠、豚鼠脊柱兩旁雙側(cè)的肺俞、厥陰俞、心俞、督俞、膈俞。穴位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠常用針灸穴位而定[1-2]。

2.2 小鼠止咳試驗(yàn)（濃氨水噴霧法）[2-3]

KM小鼠50只，采用隨機(jī)分組法分為5組，各10只（雌雄各半），即空白對照組(A組)，咳特靈組（B組，咳特靈膠囊口服灌胃），三伏三九貼給藥組(C1組、C2組、C3組)。各組于給藥前1 d備皮，將小鼠胸椎兩側(cè)（包括肺俞、厥陰俞、心俞和膈俞）毛發(fā)剪去，范圍約為2 cm×2 cm。將各樣品貼敷于整個去毛區(qū)（A組用滅菌紗布吸附后貼敷于脫毛區(qū)），用特制膠布固定，6 h后，去除覆蓋物。以上各組均每日給藥1次，連續(xù)5 d，末次給藥30 min后，將小鼠置多功能誘咳引喘儀中，采用28%氨水噴霧10 s，以小鼠出現(xiàn)腹肌收縮、縮胸、張大嘴（咳聲有無均可）作為咳嗽標(biāo)準(zhǔn)，觀察并記錄小鼠3 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)和咳嗽潛伏時間（s）。與 A組相比，B組和 C1組、C2組、C3組小鼠咳嗽潛伏期明顯延長，咳嗽次數(shù)明顯減少（P＜0.01），提示三伏三九貼對小鼠有良好的止咳作用。詳見表1。

表1 動物止咳、祛痰、平喘試驗(yàn)結(jié)果（s，n＝10）

表1 動物止咳、祛痰、平喘試驗(yàn)結(jié)果（s，n＝10）

注：與 A 組比較， P ＜0.05，＃P ＜0.01。 數(shù)據(jù)單位為 g／kg，表 2 同。

組別 小鼠止咳試驗(yàn)大鼠祛痰試驗(yàn) 豚鼠哮喘試驗(yàn)A組B組C1組C2組C3組生藥劑量（g／cm2）-0.22 0.23 0.25 0.21咳嗽潛伏期（s）23.10 ±4.93 59.60 ± 24.78＃43.80±18.71＃47.10±20.47＃35.40 ± 6.19＃咳嗽次數(shù)（次）58.70 ±8.27 12.20 ± 2.74＃23.40 ±5.87＃16.60 ±10.42＃20.40 ± 3.34＃生藥劑量（g／cm2）-0.11 0.23 0.25 0.21給藥前2 h痰液分泌量（mL）1.55 ± 0.11 1.53 ±0.12 1.47 ±0.10 1.49 ± 0.11 1.52 ±0.11給藥后2 h痰液分泌量（mL）1.62 ± 0.11 2.42 ±0.41＃2.07 ±0.46 2.00 ± 0.41 2.13 ±0.44＃生藥劑量（g／cm2）-0.082 0.23 0.25 0.21引喘潛伏期（s）69.10 ±27.19 243.70 ± 46.55＃203.90 ± 31.10＃209.90 ±46.92＃185.00 ± 32.71＃

2.3 大鼠祛痰試驗(yàn)（毛細(xì)玻管法）[4-5]

SD大鼠50只，分組、給藥方法同2.1項。試驗(yàn)前禁食不禁飲 8 ～12 h 后，給予烏拉坦 1.0 g／kg（10 mL ／kg）腹腔注射麻醉，仰位固定（注意保暖）。剪開頸部正中皮膚，分離出氣管。在甲狀軟骨下緣正中的軟骨環(huán)之間用尖銳的注射針頭扎一小孔，插入玻璃毛細(xì)管1根，剛好接觸氣管底部，吸取氣管后部之痰液。當(dāng)毛細(xì)管內(nèi)痰液充滿時，立即另換1根。以毛細(xì)管吸取痰液長度評價祛痰效果。記錄給藥前2 h和給藥后2 h痰液分泌量。與A組相比，給藥后2 h B組和C1組、C2組、C3組大鼠痰液分泌量明顯增加（P＜0.01或 P＜0.05），提示三伏三九貼對大鼠有較好的祛痰作用。詳見表1。

2.4 豚鼠哮喘試驗(yàn)[5-6]

將Hartley豚鼠放入多功能誘咳引喘儀，噴入0.2%磷酸組織胺溶液15 s，噴霧停止后觀察6 min內(nèi)豚鼠引喘潛伏期，以出現(xiàn)抽搐為標(biāo)志，將引喘潛伏期大于150 s的豚鼠淘汰，取篩選合格的豚鼠50只，分組、給藥方法同2.1項。分組后將豚鼠胸椎兩側(cè)脫毛，總面積約2 cm×3 cm，包括肺俞、厥陰俞、心俞和膈俞穴。分別給予各樣品，每組均每日給藥1次，連續(xù)5 d，末次給藥后1 h進(jìn)行試驗(yàn)。按上述篩選方法測定并記錄豚鼠的引喘潛伏期（從噴入藥液到豚鼠第1次發(fā)生抽搐的時間），若豚鼠在6 min內(nèi)無抽搐反應(yīng)，則引喘潛伏期以360 s計。與 A組相比，B組和C1組、C2組、C3組豚鼠引喘潛伏期明顯延長（P＜0.01），提示三伏三九貼對組胺所致豚鼠哮喘有明顯的平喘作用。詳見表1。

2.5 豚鼠過敏性哮喘試驗(yàn)[7-9]

取Hartley豚鼠60只，按照隨機(jī)分組法分為空白對照組，模型組，三伏三九貼A，B，C組和咳特靈（咳特靈膠囊，口服灌胃）組。參照文獻(xiàn)方法，每只豚鼠第1天腹腔注射10%OVA 0.9%氯化鈉溶液1 mL致敏。致敏第9天，背部（與人類肺俞、膈俞、膻中穴位相對應(yīng)的位置）去毛備皮，范圍約2 cm×3 cm。致敏第10天，各組隔天給藥1次，共5次。致敏第14天將豚鼠置多功能誘咳引喘儀內(nèi)，通入1%OVA 0.9%氯化鈉注射液激發(fā)，每次15 s，隔天1次，共3次。在第3次激發(fā)時，測定末次給藥1 h后豚鼠哮喘潛伏期（即從噴霧開始到豚鼠出現(xiàn)點(diǎn)頭呼吸的時間），記錄出現(xiàn)哮喘的潛伏期和哮喘情況。每只動物觀察6 min，無哮喘發(fā)作者哮喘潛伏期以360 s計。哮喘癥狀評分共分4級。1分，呼吸困難；2分，呼吸困難＋咳嗽；3分，呼吸困難＋咳嗽＋跌倒；4分，死亡；未見上述癥狀記為0分。與空白對照組比較，模型組豚鼠哮喘潛伏期明顯縮短，哮喘癥狀評分明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，咳特靈組和三伏三九貼 A，B，C組豚鼠哮喘潛伏期明顯延長（P＜0.01）、哮喘癥狀明顯減輕（P ＜0.01或 P ＜0.05）。提示三伏三九貼對 OVA引發(fā)的豚鼠過敏性哮喘有明顯的平喘作用。詳見表2。

表2 豚鼠過敏性哮喘試驗(yàn)結(jié)果（s，n＝10）

表2 豚鼠過敏性哮喘試驗(yàn)結(jié)果（s，n＝10）

注：與空白對照組比較， P ＜0.01；與模型組比較，P ＜ 0.05，＃P ＜ 0.01。

組別空白對照組模型組咳特靈組三伏三九貼A組三伏三九貼B組三伏三九貼C組生藥劑量（g／cm2）- -0.082 0.23 0.25 0.21哮喘潛伏期（s）360.00 100.90 ± 15.75 222.70 ± 21.61＃213.10 ± 20.31＃200.50 ± 28.77＃192.30 ± 26.69＃哮喘癥狀評分（分）0 2.60 ± 0.70 1.40 ± 0.70＃1.80 ± 0.79 1.80 ± 0.79 1.90 ± 0.74

3 討論

氨水為化學(xué)刺激性物質(zhì)，其氣霧吸入呼吸道后，可刺激呼吸道上皮下的感受器而引起咳嗽。本研究結(jié)果顯示，三伏三九貼能明顯延長小鼠咳嗽潛伏期，減少3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)，與空白對照組相比，有顯著差異，說明三伏三九貼具有良好的止咳作用。

哮喘、咳嗽、慢性支氣管炎疾病與痰液阻塞氣道、氣體分布不均致通氣／灌注的比例失調(diào)，從而影響通氣和換氣功能密切相關(guān)，同時液體引流不暢，也是形成肺內(nèi)炎癥的重要原因。因此，有效祛痰為治療哮喘、咳嗽、慢性支氣管炎疾病的重要方法。大鼠祛痰試驗(yàn)（毛細(xì)玻管法）是測量藥物排痰量的經(jīng)典方法。本研究結(jié)果顯示，三伏三九貼能增加氣管黏膜分泌量，具有明顯促呼吸道分泌、稀釋痰液、祛痰化痰作用。

過敏性哮喘的機(jī)制屬于Ⅰ型超敏反應(yīng)，過敏原進(jìn)入機(jī)體刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的免疫球蛋白（IgE）抗體，IgE抗體附著在肥大細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞上使之致敏，當(dāng)同一抗原再次進(jìn)入機(jī)體后，即與肥大細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，導(dǎo)致肥大細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒并釋放生物活性介質(zhì)，作用于不同的組織和器官，產(chǎn)生不同的病理生理反應(yīng)。臨床表現(xiàn)為支氣管哮喘等。將OVA這種大分子蛋白質(zhì)異物注入豚鼠體內(nèi)，經(jīng)過一定時間，豚鼠會產(chǎn)生其特異性的抗體IgE。當(dāng)豚鼠經(jīng)呼吸道再次吸入OVA（抗原）攻擊時，引起豚鼠變態(tài)反應(yīng)，釋放過敏介質(zhì)，導(dǎo)致哮喘及氣道炎性反應(yīng)，造成豚鼠過敏反應(yīng)性哮喘模型。本研究中通過吸入磷酸組胺或OVA氣霧建立豚鼠哮喘模型來觀察三伏三九貼對其的影響，結(jié)果顯示，三伏三九貼能對抗組胺或OVA引發(fā)的豚鼠哮喘，明顯延長其哮喘潛伏期，同時明顯減輕哮喘癥狀。

三伏三九貼臨床主要用于哮喘、咳嗽、慢性支氣管炎的治療，將藥物貼敷于肺俞、厥陰俞、心俞、督俞、膈俞等穴位，一方面可使藥物有效作用物質(zhì)經(jīng)皮膚吸收而發(fā)揮效應(yīng)，另一方面又可刺激穴位，激發(fā)經(jīng)氣，調(diào)整肺臟功能。兩者協(xié)同發(fā)揮止咳、祛痰、平喘作用。

綜上所述，三伏三九貼穴位貼敷對模型動物均有一定止咳、祛痰、平喘作用。