鐘文雨 ，于士龍 ，汪 宇

（1.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110042； 2.中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院，遼寧 沈陽 110042）

芪?？诜涸谥袊嗣窠夥跑姳辈繎?zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院臨床應(yīng)用已近10年，療效確切，主要用于治療皮膚瘙癢、慢性蕁麻疹、神經(jīng)性皮炎、鼻炎、哮喘等癥，為該院治療過敏性鼻炎的主要用藥。該制劑主要由黃芪、黃芩、陳皮、麻黃、當歸、細辛、桑葚等14味中藥組方，其現(xiàn)行標準僅對黃芩進行了定性鑒別，未對其主要成分進行含量測定。為進一步控制該制劑的質(zhì)量，保證臨床用藥安全有效，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對黃芪、陳皮、麻黃進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定黃芩苷含量。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器，Chemstation工作站（美國 Agilent公司）；MS105DU型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；JA5003型電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；KQ3200DB型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

芪?？诜海ㄖ袊嗣窠夥跑姳辈繎?zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院，批號分別為 20151012，20151116，20151207，規(guī)格為每支 10 mL）；黃芩苷對照品（批號為 110715-201318，純度為 98.5%），黃芪對照藥材（批號為 121054-201115），陳皮對照藥材（批號為 120908-201216），麻黃對照藥材（批號為120915-201214），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

黃芪[1-2]：取樣品 80 mL，加熱濃縮至 10 mL，加水10 mL，用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，取上層液，分別用1%氫氧化鈉溶液和正丁醇飽和水溶液各洗滌3次，每次20 mL，棄去洗滌液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪對照藥材2 g，加水20 mL，煎煮1 h，濾過，濾液同法制成對照藥材溶液。按芪?？诜禾幏胶凸に囍苽淙秉S芪的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法(以下簡稱“藥典TLC法”)試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷 -甲醇 -水（13∶5∶2，V／V／V）10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

陳皮[3-4]：取樣品20 mL，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取陳皮對照藥材2 g，加水20 mL，煎煮1 h，濾過，濾液同法制成對照藥材溶液。按芪?？诜禾幏胶凸に囍苽淙标惼さ年幮詷悠罚ㄖ瞥申幮詫φ掌啡芤?。按“藥典TLC法”試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯 -乙酸乙酯（3∶2，V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，用同一展開劑二次展開，取出，晾干。置紫外光（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

麻黃[5-6]：取樣品 40 mL，加熱濃縮至 10 mL，加水10 mL，再加濃氨試液2 mL，用二氯甲烷振搖提取2次，每次30 mL，合并二氯甲烷液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取麻黃對照藥材2 g，加水20 mL，煎煮1 h，濾過，濾液同法制成對照藥材溶液。按芪?？诜禾幏胶凸に囍苽淙甭辄S的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。按“藥典TLC法”試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯 -丁酮 -甲酸 -水（5∶3∶0.5∶0.5，V／V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵溶液，日光燈下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

2.2 黃芩苷含量測定

2.2.1 色譜條件[7-9]

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.4% 磷酸溶液（47 ∶53，V／V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：取黃芩苷對照品約25 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

供試品溶液：取樣品20 mL，離心，精密量取上清液1 mL置50 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按芪?？诜禾幏胶凸に囍苽淙秉S芩的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2.2項下各溶液適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖(見圖2)。結(jié)果陰性對照品溶液在與黃芩苷對照品溶液相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。

線性關(guān)系考察：稱取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成黃芩苷質(zhì)量濃度為200 μg／mL的對照品貯備液。分別精密量取上述貯備液并加50%甲醇稀釋，制成質(zhì)量濃度為 10，20，50，100，200 μg ／mL 的系列對照品溶液，各吸取20 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以黃芩苷質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝82.965 X-414.53，R2＝0.999 8(n＝5)。結(jié)果表明，黃芩苷質(zhì)量濃度在10～200 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取 2.2.2 項下對照品溶液 20 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.08%（n＝6），表明儀器精密度良好。

圖1 薄層色譜圖

圖2 高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗：取2.2.2項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置 0，2，6，12，24 h時按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果的 RSD為0.39%（n＝5）；表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取已知含量（40.18 μg ／mL）的樣品1.5 mL，共 6 份，分別加入黃芩苷對照品溶液（50 μg ／mL）1 mL，加50%甲醇定容至10 mL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取3批樣品各適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣，平行測定3次，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果批號為 20151012，20151116，20151207的樣品中黃芩苷含量分別為 2.009，2.016，2.014 mg ／mL。結(jié)合藥材來源，以及藥品生產(chǎn)、貯藏等因素，暫定每毫升樣品含黃芩苷不得少于2.009 mg。

3 討論

本制劑原質(zhì)量標準較簡單，僅有黃芩的定性鑒別，不僅鑒別數(shù)量過少，且未做包含陰性對照的方法學驗證試驗。本研究中參考相關(guān)文獻和大量試驗研究對原TLC法進行了驗證和修訂，解決了陰性干擾問題，并保證了試驗的重復(fù)性。此外，研究中還另建立了陳皮的TLC法，其重復(fù)性及專屬性均較好。

黃芩是芪?？诜旱木幹?，且處方量最大，具有較好的免疫抑制作用，尤其對Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)作用顯著。黃芩的這種抗炎、抗過敏作用與芪?？诜旱目惯^敏、抗支氣管痙攣和抗組胺等功能主治一致。故本研究中選擇黃芩苷作為芪?？诜旱亩恐笜?。

預(yù)試驗中對流動相體系進行了考察，分別采用了甲醇 -0.4% 磷酸溶液（28 ∶72，V／V）、甲醇 -0.4%磷酸溶液（40∶60，V／V）、甲醇 -0.4%磷酸溶液（47 ∶53，V／V）、甲醇 -0.4% 磷酸溶液（60 ∶40，V／V），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇 -0.4% 磷酸溶液（47 ∶53，V／V）為流動相時峰形和分離度均良好，故本研究中以此為流動相。

綜上所述，本研究中建立的方法操作簡便，專屬性強，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好，可用于芪?？诜旱馁|(zhì)量控制。