王玲嬌 ，孫國(guó)祥 ，戴 娜 ，楊繼章 ，于 靜

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，河北 石家莊 050031； 2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.河北省直屬機(jī)關(guān)第二門(mén)診部，河北 石家莊 050000）

木香順氣丸由木香、砂仁、香附（醋制）、檳榔、甘草、陳皮、厚樸（制）、枳殼（炒）、蒼術(shù)（炒）和青皮（炒）10 味中藥組方，傳統(tǒng)劑型為水丸，收載于2015年版《中國(guó)藥典（一部）》[1]。其具有行氣導(dǎo)滯、燥濕健脾等功效，常用于治療食積、腹痛、氣郁等癥[2]。藥典收載的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定厚樸酚含量，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道了厚樸酚的HPLC指紋圖譜[3]和甲醇提取物的指紋圖譜[4]，也有文獻(xiàn)報(bào)道橙皮苷、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯等單個(gè)或多個(gè)成分的含量[5-8]。紫外指紋圖譜可反映中藥中具有不飽和化學(xué)鍵及其共軛體系基本物質(zhì)的吸收情況，并以此控制中藥質(zhì)量[9-10]。紅外指紋圖譜不僅可反映中藥中多種化合物成分飽和鍵的吸收，且樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，無(wú)須行樣品損壞檢測(cè)[11]?？赏ㄟ^(guò)適當(dāng)校正樣本建立數(shù)學(xué)模型，應(yīng)用優(yōu)化后的數(shù)學(xué)模型和未知樣品的近紅外光譜[12-13]，進(jìn)行中藥質(zhì)量控制。本研究中利用中藥紅外-紫外光譜（IR-UV）聯(lián)用技術(shù)[14-15]建立木香順氣丸的光譜指紋圖譜，結(jié)合光譜指紋定量法宏觀定性定量評(píng)價(jià)木香順氣丸的質(zhì)量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其質(zhì)量控制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（含DAD檢測(cè)器、四元低壓梯度泵、在線(xiàn)脫氣和自動(dòng)進(jìn)樣裝置及Chem-Station工作站，美國(guó)Agilent公司）；KDM型控溫電熱套（山東鄄城華魯儀器公司）；BS110S型分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；Bruker IFS55型紅外分光光度儀（瑞士布魯克公司）。

1.2 試藥

16批木香順氣丸樣品來(lái)源見(jiàn)表1。甲醇（色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠(chǎng)），其他試劑均為分析純，水為去離子水。

表1 木香順氣丸廠(chǎng)家、批號(hào)及劑型

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 UV 光譜條件

光譜管：Agilent聚四氟乙烯（PTFE）管（600 mm ×0.17 mm）；柱溫：（30.0 ±0.15）℃ ；流動(dòng)相：甲醇 -水（50 ∶50， V／V）;流速:0.5 mL ／min;進(jìn)樣量:0.1 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):220～450 nm（DAD），數(shù)據(jù)采集間隔 0.5 nm，狹縫寬度1 nm。

2.1.2 IR 光譜條件

波段：4 000 ～ 400 cm-1；分辨率：8 cm-1；掃描速率：20 次 ／s；升溫速率：2 ℃ ／min。

2.2 供試品制備

UV光譜：取樣品約6 g，精密稱(chēng)定，加入75%乙醇50 mL回流提取1.5 h，濾過(guò)，殘?jiān)貜?fù)濾過(guò)1次，殘?jiān)性偌尤?5%乙醇40 mL回流1 h。合并3次濾液，減壓濃縮至約10 mL，然后用95%乙醇定容至25 mL，搖勻，作為供試品溶液。

IR光譜：取樣品 2丸，研磨成粉末，取1～2 mg，精密稱(chēng)定，精密稱(chēng)取150 mg干燥的KBr粉末，研磨、混勻，轉(zhuǎn)移至模具中，在低真空下用約10 GPa的壓力，經(jīng)約2 min即可將樣品壓成透明供試品薄片，精密稱(chēng)定質(zhì)量，于10 min內(nèi)測(cè)試。

2.3 IR-UV光譜定量法原理

選擇一固定對(duì)照模式（至少平均生成10批樣品，也可選用指紋對(duì)照品）作評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，分別以IR和UV光譜各數(shù)據(jù)點(diǎn)為基礎(chǔ)，分別按公式(1)(2)(3)計(jì)算樣品的IR和UV光譜與標(biāo)準(zhǔn)光譜間的宏定性相似度(Sm)、宏定量相似度(Pm)、均化系數(shù)相對(duì)偏差(α)；對(duì)IR和UV指紋圖譜反映的兩類(lèi)宏觀定性定量信息進(jìn)行等權(quán)融合，計(jì)算公式見(jiàn)（4)(5)(6），據(jù)此建立中藥IR-UV聯(lián)用指紋系統(tǒng)等權(quán)融合模型。中藥IR光譜和UV光譜突出反映了兩類(lèi)宏觀定性定量信息，IR光譜能檢測(cè)單鍵信息，可補(bǔ)償U(kuò)V光譜僅能檢測(cè)不飽和鍵的不足。這一方法構(gòu)成了基于中藥整體系統(tǒng)化學(xué)鍵振動(dòng)和價(jià)電子躍遷的光譜指紋定量法，反映的整體定性定量信息明顯好于任何單一色譜指紋圖譜和單一光譜指紋圖譜，稱(chēng)為中藥IR-UV聯(lián)用光譜指紋定量法。據(jù)此將中藥質(zhì)量劃分為8個(gè)等級(jí)（見(jiàn)表2）。

2.4 指紋圖譜的建立和評(píng)價(jià)

2.4.1 UV 光譜指紋圖譜

1)方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取編號(hào)為S1的樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，按2.1.1項(xiàng)下檢測(cè)條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以265 nm波長(zhǎng)處木香順氣丸非分離色譜圖考察進(jìn)樣精密度。結(jié)果其保留時(shí)間和峰面積的 RSD均小于0.3%（n＝6），表明方法精密度良好。

表2 中藥IR-UV聯(lián)用系統(tǒng)指紋定量法劃分中藥質(zhì)量等級(jí)

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取編號(hào)為S1的樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液 1 份，分別于 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)按2.1.1項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定，以265 nm波長(zhǎng)處木香順氣丸非分離色譜圖考察穩(wěn)定性。結(jié)果保留時(shí)間和峰面積的 RSD 分別小于 1.0% 和 3.0%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取編號(hào)為S1的樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按2.1.1項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定，以265 nm波長(zhǎng)處木香順氣丸分離色譜圖考察重復(fù)性，結(jié)果保留時(shí)間和峰面積的 RSD分別小于1.0%和3.0%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2)圖譜建立

將16批木香順氣丸分別進(jìn)樣檢測(cè)，記錄220～450nm波長(zhǎng)處的在線(xiàn)UV光譜，詳見(jiàn)圖1?？紤]到流動(dòng)相中甲醇和提取溶劑中乙醇的末端吸收，又由于波長(zhǎng)在450 nm后制劑成分基本無(wú)吸收，因此確定220～450 nm波長(zhǎng)用于鑒定其不飽和成分的含量情況。將樣品信號(hào)導(dǎo)入自主研發(fā)的中藥光譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)3.0軟件，以各數(shù)據(jù)點(diǎn)為計(jì)量單元按均值法生成對(duì)照指紋圖譜，并根據(jù)系統(tǒng)指紋定量法計(jì)算各樣品 Sm-UV，Pm-UV，αUV值。結(jié)果見(jiàn)表 3。

3)圖譜整體質(zhì)量評(píng)價(jià)（系統(tǒng)指紋定量法）

圖1 16批木香順氣丸的紫外指紋圖譜

由表3可知，質(zhì)量等級(jí)從Ⅰ級(jí)到Ⅴ級(jí)分布，來(lái)自6個(gè)廠(chǎng)家的16批樣品的質(zhì)量出現(xiàn)明顯差異，S3，S5，S10為Ⅰ級(jí)，質(zhì)量極好；S8和S14為Ⅴ級(jí)，質(zhì)量為中等。所有樣品 Sm-UV≥0.993，73.1% ≤ Pm-UV≤127.8% ，0.001≤αUV≤0.057，說(shuō)明16批樣品UV指紋數(shù)量和分布比例較相似，但整體含量仍有差異，大部分樣品質(zhì)量等級(jí)介于Ⅰ～Ⅲ級(jí)，僅S8和S14質(zhì)量等級(jí)為Ⅴ級(jí)，究其原因，主要為 Pm-UV值的顯著差異，S8 Pm-UV值過(guò)高（127.8%），S14 Pm-UV值過(guò)低（73.1%），導(dǎo)致這2批次的質(zhì)量等級(jí)為Ⅴ級(jí)。除此之外，來(lái)自同一生產(chǎn)廠(chǎng)家的藥品質(zhì)量一致性略有差異，個(gè)別廠(chǎng)家甚至差異很大，如 S5，S6，S12（山東三九藥業(yè)有限公司）質(zhì)量等級(jí)相同或相似，分布在Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)；S8，S9，S16（廣州中一制藥有限公司）樣品質(zhì)量等級(jí)分別為Ⅴ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅱ級(jí)。

2.4.2 IR 指紋圖譜

1)方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取編號(hào)為S1的樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品1份，按2.1.2項(xiàng)下檢測(cè)條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄光譜圖，導(dǎo)入中藥光譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng) 3.0 軟件。結(jié)果 SIR≥0.990 且 RSD ＝0.23%（n＝6），表明方法精密度良好。

表3 UV、IR及UV-IR鑒定16批木香順氣丸藥材質(zhì)量等級(jí)

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取編號(hào)為S1的樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品 1 份，分別于 0，1，2，3，4，6 h 時(shí)按 2.1.2 項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄光譜圖，導(dǎo)入同一軟件。結(jié)果SIR≥0.990且 RSD ＝0.15%（n＝6），表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取編號(hào)為S1的樣品，按2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品6份，按2.1.2項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄光譜圖，導(dǎo)入同一軟件，結(jié)果 SIR≥0.990且RSD ＝0.36%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2)圖譜建立

將16批樣品分別進(jìn)行IR光譜檢測(cè)，記錄400～4 000 nm波長(zhǎng)處的中藥IR光譜，詳見(jiàn)圖2。將樣品信號(hào)導(dǎo)入同一軟件，以各數(shù)據(jù)點(diǎn)為計(jì)量單元按均值法生成對(duì)照指紋圖譜，并根據(jù)系統(tǒng)指紋定量法計(jì)算各樣品 Sm-IR，Pm-IR和 αIR值。結(jié)果見(jiàn)表3。

圖2 16批木香順氣丸紅外光譜圖

3)圖譜整體質(zhì)量評(píng)價(jià)（系統(tǒng)指紋定量法）

由表3可知，各個(gè)樣品之間質(zhì)量差異很大，質(zhì)量等級(jí)最好為Ⅰ級(jí)，最差的達(dá)Ⅷ級(jí)，S1，S3，S5，S6，S16 為Ⅰ級(jí)；S10 和 S13 為Ⅱ級(jí)；S9，S14，S15 為Ⅲ級(jí)；S4，S8，S11為Ⅳ級(jí)；S2和 S7為Ⅴ級(jí)；S12為Ⅷ級(jí)。所有樣品Sm-IR≥0.983，71.6% ≤ Pm-IR≤164.6% ，0.001≤αIR≤0.074，說(shuō)明16批樣品IR指紋數(shù)量和分布比例相似，但指紋整體含量存在顯著差異。S12因 Pm-IR值過(guò)高（164.6%），未達(dá)到合格要求；而S2因 Pm-IR值過(guò)低（71.6% ），質(zhì)量評(píng)價(jià)為中等。

2.4.3 IR-UV聯(lián)用評(píng)價(jià)木香順氣丸質(zhì)量

根據(jù)公式(4)(5)(6)對(duì)UV指紋圖譜和IR指紋圖譜分析結(jié)果進(jìn)行整合，用光譜指紋定量法鑒定16批木香順氣丸質(zhì)量。結(jié)果見(jiàn)表3。16批樣品 Sm-IRUV≥0.991，表明16批木香順氣丸的化學(xué)成分的種類(lèi)和分布比例十分相似。S3，S5，S6，S8，S9，S10，S15，S16 質(zhì)量為極好（Ⅰ級(jí)），S1 和 S7 質(zhì)量為很好（Ⅱ級(jí)），S2，S4，S11，S13，S14質(zhì)量為好（Ⅲ級(jí)），S12質(zhì)量為中等（Ⅴ級(jí)）。

2.4.4 不同分析方法評(píng)價(jià)結(jié)果比較

由圖3可知，16批樣品在不同分析方法下的質(zhì)量等級(jí)評(píng)定結(jié)果不同。如S12在UV光譜指紋圖譜、IR光譜指紋圖譜和整合法時(shí)質(zhì)量等級(jí)分別為Ⅱ級(jí)、Ⅷ級(jí)和Ⅴ級(jí)。采用IR和UV指紋圖譜分別計(jì)算16批木香順氣丸的 Sm均不低于0.99，2種方法均證明，各批樣品化學(xué)成分種類(lèi)和分布比例都十分相似，由于IR和UV光譜檢測(cè)原理的顯著不同，導(dǎo)致宏定量相似度 Pm差異很大。上述不同分析方法的定量相似度見(jiàn)圖4。

圖3 不同評(píng)價(jià)方法得到的樣品質(zhì)量等級(jí)

圖4 不同評(píng)價(jià)方法得到的樣品定量相似度結(jié)果

3 討論

中成藥化學(xué)成分非常復(fù)雜，單一地采用UV或近IR分析技術(shù)分析時(shí)，并不能真實(shí)全面地反映中藥的質(zhì)量。本研究中以IR檢測(cè)單鍵信息，以彌補(bǔ)UV僅能檢測(cè)不飽和鍵的不足，實(shí)現(xiàn)了IR-UV聯(lián)用對(duì)木香順氣丸進(jìn)行整體定性和整體定量的快速鑒定，基于光譜學(xué)的簡(jiǎn)單、快捷并在多組分未分離的情況下得到整體的數(shù)據(jù)來(lái)區(qū)別中成藥的質(zhì)量等級(jí)，試圖全方位、多角度揭示中藥復(fù)雜的特征，為其質(zhì)量控制提供新思路。由于中藥信息的量大及不確定性可能會(huì)使制劑的質(zhì)量等級(jí)在不同分析方法中發(fā)生較大差異，多種分析方法的聯(lián)合或許能進(jìn)一步縮小誤差，從而使試驗(yàn)結(jié)果更接近中藥的真實(shí)質(zhì)量。但光譜指紋圖譜不能揭示藥物確定的有效成分，也不能解釋生物活性成分和質(zhì)量等級(jí)的相關(guān)性，因此結(jié)合中藥的藥效學(xué)構(gòu)建更全面的定性定量光譜指紋學(xué)的質(zhì)控模型得進(jìn)一步研究。