宋振國，吳小瑜，程沁園，陳 慧，龍苗苗

（無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術學校藥學系，江蘇 無錫 214028）

阿霉素（DOX）為廣譜抗腫瘤藥物，可通過嵌入DNA阻斷核酸分子的合成，但會對機體正常細胞產生廣泛的生物化學效應，從而對人體正常組織產生強烈的毒副作用[1]。脂質體(LP)為具有類細胞膜的雙分子層脂質膜結構的微小囊泡，具有自行密合的特性，可包載疏水性或／和親水性藥物。脂質體具有的納米尺寸可通過高滲透滯留效應（EPR）被動靶向到腫瘤部位，將脂質體作為阿霉素藥物遞送載體，可提高腫瘤部位藥物濃度，降低藥物的毒副作用[2-5]。目前已有多種阿霉素脂質體上市，但僅依靠EPR，普通阿霉素脂質體無法主動靶向腫瘤細胞，故研發(fā)功能化脂質體尤為重要。透明質酸（HA）為線性多糖，具有生物相容性好和生物可降解性等優(yōu)點。HA可與腫瘤細胞表面過量表達的CD44受體結合，具有靶向腫瘤細胞的功能。故可作為藥物載體用于靶向傳遞藥物，增加藥物在腫瘤部位的蓄積，有效抑制腫瘤細胞生長[6-7]。此外，與磷脂相比，多糖聚合物在體內降解較緩慢，將其修飾于脂質體表面，可提高脂質體的穩(wěn)定性，增加其在體內的循環(huán)時間[8-9]。硬脂胺為親脂性陽離子化合物，通過加入少量硬脂胺調節(jié)脂質體表面電荷，可提高其穩(wěn)定性，而且用于制備的陽離子脂質體具有肺部癌癥靶向治療作用[10]。本研究中通過引入HA-硬脂胺聚合物（HS），制備功能化阿霉素脂質體，并對其體外性質和抗腫瘤活性進行研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州科泰實驗設備有限公司）；RV10BS96型旋轉蒸發(fā)儀（德國IKA儀器設備有限公司）；UV-1800型紫外分光光度計（日本島津儀器有限公司）；JEM-2100型透射電子顯微鏡（日本Jeol公司）；Zetasizer Nano ZS型納米粒度分析儀（英國Malven公司）；JY92-ⅡN型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DMIL LED型倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；FACSCalibur型流式細胞儀（美國 Beckman Coulter公司）。

1.2 試藥

鹽酸阿霉素（大連美侖生物技術有限公司，批號為J0614A，純度＞98%）；HA（華熙福瑞達生物醫(yī)藥有限公司，批號為1409191，相對分子質量為5 300）；大豆磷脂（上海太偉有限公司，純度98%）；硬脂胺（阿拉丁試劑有限公司）；膽固醇（上海生工生物工程股份有限公司）；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC）均購自上海晶純生化科技股份有限公司；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 HS 的合成

將 HA（含 0.25 mmol羧基）100 mg溶于 10 mL 無水甲酰胺中，加入等濃度比的 EDC和 NHS（60 mg）活化。稱取硬脂胺72 mg，溶于 N，N-二甲基甲酰胺，然后緩慢滴加入上述溶液中，氮氣保護下反應48 h。反應結束后用蒸餾水透析（截留相對分子質量為3.5×103）3 d，冷凍干燥得HS。通過1H-NMR確證聚合物化學結構。結果見圖1。表明硬脂胺已成功鏈接到HA主鏈上。

圖1 HS的核磁共振氫譜

2.2 功能化阿霉素脂質體的制備與表征

制備：稱取磷脂500 mg和膽固醇50 mg，溶于無水乙醚，逐滴加入鹽酸阿霉素溶液2 mg，旋轉蒸發(fā)除盡有機溶劑，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)10 mL，水化30 min后冰浴超聲10 min，然后加入HS溶液，50℃恒溫孵育1 h，得功能化阿霉素脂質體（DOX／LP／HS）。同法制備阿霉素普通脂質體（DOX ／LP）。

粒徑及Zeta電位測定：取適量脂質體溶液置測量杯內，采用動態(tài)光散射技術（DLS）測定脂質體的粒徑、多分散系數（PDI）和 Zeta電位。DOX／LP的粒徑為（47.17 ±0.85）nm，PDI為 0.297 ±0.08；經 HS 聚合物修飾后，DOX ／LP ／HS 粒徑變化不大，為（51.97±0.95）nm，PDI為 0.286 ±0.07，分布較好（圖 2 A）。DOX ／LP 的Zeta 電 位 為 （-4.64±0.81）mV，經 HS 修 飾 后 ，DOX ／LP ／HS 的電位降低到（-9.48±0.55）mV，這是由于HA結構中存在大量羧基所致。表面的負電有利于防止脂質體聚沉，避免血漿蛋白吸附，提高在血液中的穩(wěn)定性。

透射電鏡觀察：通過透射電鏡（TEM）觀察脂質體形貌特征及粒徑分布。取脂質體分散液滴于銅網上，晾干后滴加磷鎢酸對其負染，室溫干燥后用TEM進行觀察。透射電鏡圖可以看出DOX／LP／HS形貌呈球形或類球形，分布較窄（圖2 B）。說明脂質體具有較好的粒徑及分布，適宜作為抗腫瘤藥物載體。

圖2 DOX／LP／HS粒徑分布圖及透射電鏡圖

包封率測定：準確量取定量DOX／LP／HS，加入甲醇10 mL超聲破壞后，在480 nm波長處測定吸光度，計算藥物總含量。取2.2的“制備”項下脂質體2.0 mL，置截留相對分子質量為3 000的超濾杯中，10 000 r／min離心50 min，測得游離藥物含量，并計算包封率（EE）。結果，DOX ／LP 包封率為（94.8 ± 1.95）%，DOX ／LP ／HS包封率為（98.34±1.02）%，表明兩種脂質體對藥物均有較好的包載能力。HS插入脂質體雙分子結構中，可使載藥空間增大，一定程度上提高了脂質體對藥物的包封率。

2.3 體外藥物釋放

采用動態(tài)透析法測定體外釋放行為。向透析袋中加入脂質體 2 mL，將透析袋置 PBS（pH ＝7.4，0.01 mmol／L）溶液 10 mL，在 100 r／min，（37 ±0.5）℃的搖床震蕩，分別于不同時間取樣1 mL，并加入新鮮PBS 1 mL。于480 nm波長處測定吸光度，并計算含量及累積釋放度。DOX／LP和DOX／LP／HS的體外釋放行為見圖3。2種脂質體在10 h內的藥物釋放低于20%，表明DOX幾乎全部包載于脂質體中，無明顯突釋現象。隨著時間的延長，脂質體內藥物緩慢釋放，具有明顯緩釋作用。48 h時，DOX／LP／HS的累積釋放度低于DOX／LP，這可能是由于HS的疏水段硬脂烷鏈插入脂質體雙分子層膜，導致疏水作用力增強，結構更緊密，不利于藥物向外自由擴散。

圖3 DOX／LP和 DOX／LP／HS體外釋放行為

2.4 穩(wěn)定性考察

將裝有脂質體混懸液的 10 mL棕色瓶置（4±0.5）℃冰箱中，不同時間用馬爾文粒徑儀測量脂質體粒徑，考察其穩(wěn)定性。此外，將制備的脂質體混懸液置（4±0.5）℃冰箱中，不同時間取樣測定包封率，然后計算6 d后脂質體泄漏率[泄漏率＝(第1天包封率-第6天包封率)／第 1天包封率 ×100%]。DOX／LP和 DOX／LP／HS放置的粒徑變化見圖4。可見，隨著放置時間的延長，脂質體粒徑均有所增加。其中第8天時，DOX／LP粒徑急劇變大，并出現多峰，而DOX／LP／HS粒徑變化不大，說明經HA修飾后，脂質體的穩(wěn)定性有所提高。

圖4 DOX／LP和 DOX／LP／HS的粒徑變化

DOX／LP和 DOX／LP／HS放置 6 d后的泄漏率分別為（4.94 ±0.5）% 和（1.93 ± 0.05）% ，DOX ／LP ／HS明顯低于DOX／LP，說明脂質體經HS修飾后提高了脂質體結構的致密性，使藥物不易泄露，提高了脂質體穩(wěn)定性。

2.5 腫瘤靶向性評價

流式細胞儀測定：將MCF-7和COS7細胞按照3×105個／孔的密度加到6孔板培養(yǎng) 24 h，加入2 mL游離 DOX，DOX ／LP，DOX ／LP ／HS（阿霉素終質量濃度為 5 μg ／mL）孵育 1，2，4 h(以細胞培養(yǎng)液為空白對照)，胰酶消化后，收集細胞，加入PBS 500 μL分散細胞后，用流式細胞儀測定相對熒光強度，代表攝取水平，結果見圖5?？梢?，2種細胞對脂質體的攝取均有明顯的時間依賴性。由于COS7細胞表面缺乏CD44受體的表達，DOX／LP／HS和DOX／LP在各個時間點的攝取無明顯差異。而DOX／LP／HS在MCF-7細胞內的攝取率明顯高于DOX／LP，這是因為HS修飾的阿霉素脂質體可通過細胞表面的CD44受體介導進入細胞，增加細胞內的藥物蓄積量，具有更好的抗腫瘤作用。

圖5 不同制劑在細胞中的攝取率

熒光顯微鏡觀察：為了驗證CD44受體介導的靶向作用，采用倒置熒光顯微鏡進一步觀察 DOX／LP和DOX／LP／HS在MCF-7細胞內的攝取及分布情況。細胞以1.0×104個／孔的密度進行接種，孵育24 h。棄去原培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，加入500 μL含游離DOX，DOX ／LP，DOX ／LP ／HS（DOX 的終質量濃度為 5 μg／mL）孵育1，2，4 h。然后PBS潤洗 3次，加入 4%多聚甲醛固定 20 min，Hoechst溶液（10 μg ／mL）染色 20 min，PBS 清洗后在熒光顯微鏡下觀察、拍照。

由圖6可見，隨著時間的延長，藥物進入細胞的量逐漸增多，部分藥物進入細胞核中，表現出時間依賴性。孵育時間為4 h時，游離DOX通過快速擴散入胞最多，且均進入細胞核內。與 DOX／LP相比，DOX／LP／HS的熒光強度明顯增強，且主要集中于細胞核內，表明DOX／LP／HS具有更好的腫瘤細胞靶向性。以上結果表明，DOX／LP／HS能與腫瘤細胞表面的 CD44受體結合，提高藥物的攝取量，更有效地發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖6 不同制劑在MCF-7細胞中的攝取熒光圖（×40）

3 討論

脂質體主要由磷脂和膽固醇形成類似細胞膜的雙分子層結構，具有與細胞膜融合性好和生物相容性佳等特點，且可包載親水性和親脂性藥物，故被廣泛用于抗腫瘤藥物的傳遞載體。DOX是臨床常用的蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，但其具有嚴重的心臟毒性等毒副作用，臨床應用受限。目前上市的DOX／LP／HS能降低藥物的心臟毒性，但穩(wěn)定性差，藥物易滲漏，易受RES影響，雖然經聚乙二醇修飾可提高脂質體表面的親水性，阻止血漿蛋白吸附，減少吞噬吸收，但其僅依靠EPR被動靶向到腫瘤部位，無法進一步提高腫瘤部位的藥物蓄積。通過配體對脂質體表面進行修飾是提高其靶向性的有效手段。多糖聚合物可提高疏水性藥物的水溶性，易于對結構進行修飾，連接各類配體，因而在抗腫瘤靶向給藥系統(tǒng)備受關注[11-13]。HA可與大部分腫瘤細胞過表達的CD44受體結合，通過靶向介導更多藥物進入腫瘤細胞，抑制腫瘤生長[7，14]。

本研究中主要合成HS，修飾脂質體，提高脂質體的靶向性和穩(wěn)定性。通過考察HS的修飾方法發(fā)現，后插入法HS可以自發(fā)嵌入脂質體結構中，得到粒徑更均一的脂質體。且 DOX／LP／HS的穩(wěn)定性優(yōu)于 DOX／LP。硬脂胺等陽離子化合物可通過調節(jié)脂質體表面電荷提高其穩(wěn)定性[8]。此外，通過體外釋放等試驗結構推測，HS的疏水段插入脂質體雙分子層膜，導致疏水作用力增強，結構更緊密，降低了脂質體的泄漏率。DOX／LP／HS可與MCF-7細胞表面的CD44受體結合，具有更高的攝取量和細胞內蓄積率。

綜上所述，本研究為構建功能化脂質體作為抗腫瘤藥物載體提供了參考。但本研究中僅對HS修飾的功能化脂質體的制備及物理性質進行了研究，后續(xù)試驗應深入考察其體內外抗腫瘤活性。