趙 婧，李 強，何 玲

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒科，四川南充 637000)

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是圍產(chǎn)期窒息嚴(yán)重并發(fā)癥之一，病死率及致殘率高[1-2]。目前認(rèn)為大腦缺氧缺血(hypoxia-ischemia,HI)，影響神經(jīng)突極性結(jié)構(gòu)，破壞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成，可能是引起HIE神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的重要原因之一[3]。迄今，已發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元極性分子糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)及磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol-3 kinase/Akt,PI3K/Akt)在神經(jīng)突極性建立與維持中發(fā)揮重要作用[4-5]。在HI神經(jīng)元中，PI3K/AKT/GSK-3β信號通路是否參與神經(jīng)元損傷的調(diào)節(jié)及其信號傳遞的機制等尚不清楚。因此，本研究在建立新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元氧糖剝奪(oxygen and glucose deprivation,OGD)模型，模擬HI基礎(chǔ)上，應(yīng)用PI3K/Akt抑制劑LY294002和GSK-3β抑制劑SB415286進行干預(yù)，檢測Akt、p-Akt(Ser-473)、GSK-3β、p-GSK-3β(ser-9)的表達變化及神經(jīng)突形態(tài)、長度變化，明確PI3K/Akt/GSK-3β信號通路在HI神經(jīng)元損傷中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1試劑 LY294002、SB415286購于美國Cell signaling公司，兔抗鼠Akt、p-Akt (ser-473)抗體、兔抗鼠GSK-3β、p-GSK-3β(ser-9)抗體、小鼠微管蛋白TUJ1單克隆抗體購于美國Millipore公司，小鼠β-actin單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購于美國Chemicon公司，磷酸酶抑制劑、化學(xué)發(fā)光試劑盒購于美國Chemicon公司，Western blot一抗、二抗去除液購于碧云天公司。

1.2方法

1.2.1原代神經(jīng)元培養(yǎng) 新生SD大鼠在75%乙醇中浸泡3～5 min，無菌條件下斷頭殺死，取出大腦。在解剖鏡下分離出大腦皮質(zhì)并剪碎，以0.25% 胰蛋白酶和終濃度為10 μg/mL 的DNAseⅠ消化，通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加含2% B27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑、1%谷氨酰胺的無血清神經(jīng)培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液，以2×106/mL的細(xì)胞密度接種于多聚L賴氨酸(PLL)包被的6孔板蓋玻片或25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)2 d后半量換液，培養(yǎng)至第7天用于實驗。

1.2.2體外模擬HI 建立體外OGD模型[6]。將原代培養(yǎng)至第7天的神經(jīng)元棄去培養(yǎng)液，加入無糖DMEM培養(yǎng)液模擬細(xì)胞缺血狀態(tài)，再將細(xì)胞放入3氣培養(yǎng)箱中，用含95% N2、5% CO2混合氣從進氣管充氣，培養(yǎng)3 h。3 h后終止缺氧，并更換為含葡萄糖的神經(jīng)元培養(yǎng)基，以形成再灌注。取再灌注后0.5、3、6、12、24、48 h不同時間點的神經(jīng)元進行實驗。

1.2.3實驗分組 實驗分為4組：(1)正常對照組：正常培養(yǎng)液孵育的神經(jīng)元；(2)OGD組：模型制備后，取再灌注0.5、3、6、12、24、48 h觀察；(3)LY294002干預(yù)組：應(yīng)用LY294002(20 μmol/L)預(yù)處理神經(jīng)元12 h，再以相同濃度在OGD中維持3 h后更換為含葡萄糖的神經(jīng)元培養(yǎng)基；(4)SB415286干預(yù)組：應(yīng)用SB415286(40 μmol/L)預(yù)處理神經(jīng)元12 h，再以相同濃度在OGD中維持3 h后更換為含葡萄糖的神經(jīng)元培養(yǎng)基。

1.2.4Western blot檢測各組神經(jīng)元Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達 冰上提取神經(jīng)元蛋白后，BCA法測定蛋白濃度，-80 ℃保存。等量的樣品蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)膜，相繼加入相應(yīng)的一抗及二抗進行免疫反應(yīng)，ECL發(fā)光劑顯色，置于Omega 12 ic凝膠成像儀中顯像并拍照，應(yīng)用NIH圖像測其吸光度(OD)值,以目的蛋白條帶OD值/β-actin條帶OD值來表示目的蛋白表達水平。

1.2.5神經(jīng)突免疫熒光染色 采用免疫熒光標(biāo)記TUJ1。6孔板培養(yǎng)神經(jīng)元，4%多聚甲醛4 ℃固定20 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗3次后滴加免疫熒光封閉液，4 ℃孵育30 min，滴加TUJ1一抗(1∶200)，4 ℃孵育過夜；PBS洗3次后滴加異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記二抗(1∶200)，37 ℃孵育40 min；滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，常溫孵育5 min；封片后熒光顯微鏡下鏡檢。

2 結(jié) 果

2.1OGD后Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達 總Akt(F=1.214,P>0.05)及總GSK-3β(F=0.376,P>0.05)的表達在OGD后未發(fā)生變化。p-Akt在OGD后0.5 h明顯降低，在經(jīng)過短暫升高后(OGD后3、6 h)，在12 h開始下降，24 h降至最低(F=525.33,P<0.05)。p-Akt/Akt值，在OGD后24 h降至最低(F=674.46,P<0.05)，見圖1。p-GSK-3β在OGD后0.5 h開始降低，24 h降至最低(F=557.243,P<0.05)。p-GSK-3β/GSK-3β值在OGD后24 h降至最低(F=376.581,P<0.05)，見圖1。

A：皮質(zhì)神經(jīng)元OGD后Akt、p-Akt表達的Western blot圖；B：定量分析p-Akt/Akt；C：皮質(zhì)神經(jīng)元OGD后GSK-3β、p-GSK-3β表達的Western blot圖；D：定量分析p-GSK-3β/GSK-3β；N:正常對照組；a：P<0.05，與對照組比較

A：Akt和p-Akt蛋白表達的Western blot圖；B：定量分析p-Akt/Akt；C：GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表達的Western blot圖；D：定量分析p-GSK-3β/GSK-3β；1：OGD 6 h組；2：正常對照組；3:LY294002干預(yù)組；a：P<0.01，與OGD組比較

2.2LY294002抑制Akt、GSK-3β磷酸化 Western blot結(jié)果顯示，LY294002干預(yù)后，總Akt和GSK-3β并未發(fā)生變化，而p-Akt和p-GSK-3β表達減少(P<0.05)。與OGD 6 h組比較，p-Akt/Akt及p-GSK-3β/GSK-3β在應(yīng)用LY294002后分別降低了約49%(F=242.263,P<0.01)和42%(F=128.114,P<0.01)，而OGD 6 h組和正常對照組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

2.3SB415286促進GSK-3β磷酸化 Western blot結(jié)果顯示，SB415286干預(yù)后，總Akt、p-Akt和總GSK-3β并未發(fā)生變化，而p-GSK-3β表達增加(P<0.05)。與OGD 6 h組比較， p-GSK-3β/GSK-3β在應(yīng)用SB415286后增加了37% (F=122.347,P<0.01)，而OGD 6 h組和正常對照組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

A：Akt和p-Akt蛋白表達的Western blot圖；B：定量分析p-Akt/Akt；C：GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表達的Western blot圖；D：定量分析p-GSK-3β/GSK-3β；1：OGD 6 h組；2：正常對照組；3:SB415286干預(yù)組；a：P<0.01，與OGD組比較

A：培養(yǎng)第7天神經(jīng)元；B：OGD后24 h組神經(jīng)元；C：OGD后48 h組神經(jīng)元；D：正常對照組神經(jīng)元；E：LY294002干預(yù)組神經(jīng)元(OGD后48 h)；F：SB415286處理組神經(jīng)元(OGD后48 h)

2.4抑制PI3K/Akt活性加重HI后神經(jīng)元神經(jīng)突損傷 如圖4所示，綠色熒光標(biāo)記的是TUJ1，藍色標(biāo)記的是細(xì)胞核。培養(yǎng)至第7天的神經(jīng)元形成成熟的極性結(jié)構(gòu)，即數(shù)個樹突及1個軸突染成綠色熒光，采用Neurocida軟件測量軸突平均長度為(5 287±262) μm。OGD后24 h，神經(jīng)元胞體及神經(jīng)突近端腫脹，可見固縮或碎裂的細(xì)胞核軸突平均長度為(2 985±225)μm。48 h后神經(jīng)突變細(xì)、變直、斷裂，分支減少，軸突長度為(1 086±67)μm。以O(shè)GD后形態(tài)變化較明顯的時間點48 h作為對照，LY294002干預(yù)組在OGD后48 h，神經(jīng)元極性結(jié)構(gòu)消失，僅可見圍繞胞體短細(xì)的突起，平均長度為(445±85)μm。應(yīng)用LY294002后明顯加重神經(jīng)突損傷，軸突長度較OGD 48 h組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.5抑制GSK-3β活性減輕缺氧缺血后神經(jīng)元神經(jīng)突損傷 SB415286處理組在OGD 48 h后，神經(jīng)突近端稍有腫脹，遠端稍變細(xì)，分枝稍減少，與OGD 48 h組[(1 086±67)μm]比較軸突長度明顯更長，平均長度為(2 692±207)μm，見圖4F。應(yīng)用SB415286后可減輕神經(jīng)突損傷，軸突長度較OGD 48 h組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

神經(jīng)突是神經(jīng)元傳遞和接受神經(jīng)信號沖動的基本結(jié)構(gòu)，也是神經(jīng)元極性結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)。在許多神經(jīng)退行性疾病中都涉及神經(jīng)突結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元極性的損傷[7-9]。因此，探索引起神經(jīng)突損傷的分子機制及實施相應(yīng)的干預(yù)措施十分重要。本研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)神經(jīng)元OGD后24 h形態(tài)已經(jīng)發(fā)生明顯變化，神經(jīng)突變短，OGD后48 h神經(jīng)突分支減少、斷裂。這種結(jié)構(gòu)改變可能與HI后不可逆的神經(jīng)元功能損傷有關(guān)。

在對神經(jīng)元極性形成和維持的分子生物學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，高活性的Akt(Myr-Akt)能促進軸突生長[4]。并且通過上調(diào)PI3K增強Akt磷酸化后可促進外周神經(jīng)再生[5]。PI3K/Akt通過磷酸化調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白等途徑促進細(xì)胞生長、抑制細(xì)胞凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，p-Akt在OGD后0.5及12 h明顯降低，并在后續(xù)時間點持續(xù)低表達，提示與相應(yīng)時間點神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷相關(guān)。本研究同時發(fā)現(xiàn)在OGD后3、6 h p-Akt有短暫性升高，這可能與HI早期的神經(jīng)元試圖通過上調(diào)Akt活性減輕損傷有關(guān)[11]，但這種短暫性的Akt活性改變并不能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)突結(jié)構(gòu)損傷。

GSK-3β是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶[12]。GSK-3β在神經(jīng)突的磷酸化狀態(tài)對神經(jīng)元極性結(jié)構(gòu)形成起決定作用[13]。神經(jīng)元共轉(zhuǎn)染高活性的GSK-3β(GSK-3βS9A)和高活性的Akt(Myr-Akt)后，可逆轉(zhuǎn)Myr-Akt誘導(dǎo)形成的多根軸突[14]。本研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元OGD后p-GSK-3β的表達持續(xù)降低，這種變化可能與神經(jīng)突損傷相關(guān)。同時發(fā)現(xiàn)在OGD后12 h p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β的比值變化趨勢基本一致，表明兩者可能存在一定聯(lián)系。因此進一步檢測抑制PI3K/Akt或GSK-3β活性，探討3個蛋白間的調(diào)控關(guān)系。

LY294002和SB415286分別是PI3K/Akt和GSK-3β的特異性抑制劑[15-16]。抑制PI3K/Akt活性后，神經(jīng)元p-GSK-3β表達降低。而抑制GSK-3β后，神經(jīng)元Akt及p-Akt的表達均未發(fā)生變化，表明參與OGD后神經(jīng)元損傷的分子調(diào)節(jié)中，GSK-3β是PI3K/Akt的下游信號分子。同時LY294002組神經(jīng)突在OGD后48 h極性結(jié)構(gòu)消失，表明抑制PI3K/Akt活性明顯加重神經(jīng)突損傷。而SB415286抑制GSK-3β后可部分逆轉(zhuǎn)神經(jīng)突的損傷，盡管軸突長度未完全恢復(fù)至正常狀態(tài)，但神經(jīng)元極性結(jié)構(gòu)得以維持。筆者推測這可能與在體外模型中，神經(jīng)元生長的環(huán)境單一，缺乏其他細(xì)胞合成的促修復(fù)和發(fā)育的蛋白分子,這在一定程度上影響了損傷的修復(fù)。

總之，體外培養(yǎng)神經(jīng)元OGD后PI3K/Akt的活性發(fā)生變化，通過調(diào)控下游蛋白GSK-3β的磷酸化參與神經(jīng)突損傷調(diào)節(jié)機制，干預(yù)PI3K/Akt/GSK-3β信號通路可能有助于受損神經(jīng)突的修復(fù)。