張冬梅,孫鳳英，藺香云

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院：1.生殖醫(yī)學(xué)科；2.麻醉科；3.婦產(chǎn)科，山東濱州 256603)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病率占妊娠總數(shù)的1%～3%，研究顯示遺傳、內(nèi)分泌異常、感染、自身抗體、凝血機(jī)制等均與其發(fā)生有關(guān)，但仍有50%患者病因不明確[1]。kisspeptin受體kiss1r 屬于腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲因子，在乳腺癌、黑色素瘤中研究顯示其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力呈負(fù)相關(guān)[2-3]。近期研究顯示kiss1r 與胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)異常及胎盤功能不良有關(guān)，在不良妊娠者血清中呈低表達(dá)[4]?；谝陨涎芯客茰y(cè)其還可能與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。本研究通過檢測(cè)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病例絨毛組織中kisspeptin、kiss1r的表達(dá)，并在體外進(jìn)行驗(yàn)證，探究復(fù)發(fā)性流產(chǎn)可能的病理機(jī)制，為臨床治療提供一定的參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年4月至2017年5月在本院進(jìn)行治療的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者46例進(jìn)行研究(病例組)，年齡20～35歲，平均(27.54±4.18)歲，另選取20例人工流產(chǎn)患者作為對(duì)照組，年齡22～36歲，平均(28.13±3.66)歲，所納入對(duì)象均月經(jīng)規(guī)律、知情同意，無慢性病史、生殖道畸形、染色體異常、感染、妊娠內(nèi)分泌相關(guān)疾病，未近期服用激素藥物等。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本來源 患者入院時(shí)采集靜脈血3 mL，保存于-20 ℃以備后續(xù)使用?；颊呓?jīng)刮宮術(shù)取出的妊娠組織在生理鹽水中漂洗后，分離新鮮絨毛組織，一部分置于-80 ℃中保存，一部分置于4%多聚甲醛溶液中。JAR、JEG-3絨癌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法 采用RNA試劑盒提取絨毛組織RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR反應(yīng)體系為20.0 μL：SYBR Premix 10.0 μL，cDNA 1.0 μL，H2O 8.0 μL，上下游引物各0.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共循環(huán)40 次。以GADPH作為內(nèi)參計(jì)算kisspeptin、kiss1r mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3Western blot法 收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心后添加裂解液反應(yīng)30 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，結(jié)束后置于凝膠成像儀中觀察蛋白表達(dá)情況。

1.2.4免疫組織化學(xué)法 常規(guī)制備絨毛組織切片(4 μm)，用二甲苯脫蠟，參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。每張切片挑選10個(gè)視野，計(jì)算陽性染色細(xì)胞數(shù)比例。

1.2.5血清中性激素相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、促黃體生成激素 (leuteinizing hormone，LH)、雌二醇(estriol，E2)、催乳素(prolactin， PRL)及孕酮(progesterone,P)水平。

1.2.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染 構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-kiss1r，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，細(xì)胞饑餓培養(yǎng)1 h，參照試劑盒分別轉(zhuǎn)染JAR、JEG-3細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組、kiss1r轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，隨后收集細(xì)胞上清液，進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。

1.2.7細(xì)胞增殖測(cè)定 收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，添加至96孔培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h，棄上清液，向孔內(nèi)加入20 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在酶標(biāo)儀中檢測(cè)460 nm處吸光度值。

1.2.8平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆形成 將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞接種在96孔板中孵育24 h后，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗細(xì)胞3次，加入4%甲醛溶液(甲硫醇∶冰乙酸=7∶1)固定15 min，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d。用固定劑固定15 min后，用含0.1% Gimsa溶液染色30 min后，干燥后拍照計(jì)數(shù)克隆形成個(gè)數(shù)。

1.2.9Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞饑餓培養(yǎng)24 h后，在Transwell上室加入300 μL細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含胎牛血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，保留室內(nèi)下層細(xì)胞，清理未遷移細(xì)胞，加入結(jié)晶紫染液染色15 min，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.10Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液60～80 μL包被Transwell小室聚碳酸酯膜的上室面，置于37 ℃使其風(fēng)干呈凝膠狀態(tài)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染正常培養(yǎng)后，后續(xù)操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.11轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，參照方法1.2.3 進(jìn)行蛋白檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1所有對(duì)象組織中kisspeptin、kiss1r表達(dá) 與對(duì)照組比較，病例組中kisspeptin、kiss1r表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表1。

2.2kisspeptin、kiss1r表達(dá)與患者性激素水平關(guān)系 與kisspeptin、kiss1r陽性表達(dá)者比較，kisspeptin、kiss1r陰性表達(dá)者LH水平升高，PRL、E2、P水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

A：對(duì)照組；B：病例組

表1 絨毛組織中kisspeptin、kiss1r表達(dá)比較

a：P<0.05，與對(duì)照組比較

表2 kisspeptin、kiss1r表達(dá)與患者性激素水平關(guān)系

a：P<0.05，與kisspeptin陽性表達(dá)比較；b：P<0.05，與kiss1r陽性表達(dá)比較

2.3細(xì)胞中kisspeptin/kiss1r表達(dá) 與空白對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組比較，kiss1r轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中kisspeptin、kiss1r蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)，見圖2、表3。

A：空白對(duì)照組；B：陰性轉(zhuǎn)染組；C：kiss1r轉(zhuǎn)染組

2.4細(xì)胞增殖情況 隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，kiss1r轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率逐漸升高，在同一時(shí)間點(diǎn)，與空白對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組比較，kiss1r轉(zhuǎn)染組增殖率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表3 轉(zhuǎn)染后kisspeptin、kiss1r表達(dá)情況

a：P<0.05，與空白對(duì)照組比較；b:P<0.05，與陰性轉(zhuǎn)染組比較

表4 轉(zhuǎn)染后JAR、JEG-3細(xì)胞增殖率比較

a：P<0.05，與空白對(duì)照組比較；b:P<0.05，與陰性轉(zhuǎn)染組比較

A：空白對(duì)照組；B：陰性轉(zhuǎn)染組；C：kiss1r轉(zhuǎn)染組

2.5細(xì)胞克隆形成情況 與空白對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組比較，kiss1r轉(zhuǎn)染組細(xì)胞菌落數(shù)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、表5。

表5 細(xì)胞菌落數(shù)量比較個(gè))

a：P<0.05，與空白對(duì)照組比較；b:P<0.05，與陰性轉(zhuǎn)染組比較

2.6細(xì)胞遷移、侵襲情況比較 與空白對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組比較，kiss1r轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、表6。

2.7細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá) 與空白對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組相比，kiss1r轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5、表7。

A：空白對(duì)照組；B：陰性轉(zhuǎn)染組；C：kiss1r轉(zhuǎn)染組

表6 各組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量比較個(gè))

a：P<0.05，與空白對(duì)照組比較；b:P<0.05，與陰性轉(zhuǎn)染組比較

A：空白對(duì)照組；B：陰性轉(zhuǎn)染組；C：kiss1r轉(zhuǎn)染組

表7 MMP-2、MMP-9表達(dá)情況

a：P<0.05，與空白對(duì)照組比較；b:P<0.05，與陰性轉(zhuǎn)染組比較

3 討 論

kisspeptin及其受體kiss1r與腫瘤的侵襲、遷移密切相關(guān)[5]。kisspeptin及其受體kiss1r的缺失可導(dǎo)致低促性腺激素功能減退，使生殖功能調(diào)控發(fā)生紊亂[7-8]。本研究顯示復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織kisspeptin、kiss1r表達(dá)均低于對(duì)照組，與以往結(jié)果相符[9]，提示kisspeptin、kiss1r可能與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)。ZABETIAN等[10]通過對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者滋養(yǎng)層細(xì)胞中kisspeptin進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示其水平明顯低于正常妊娠者。子癇前期、胎兒受限血清kisspeptin水平均低于正常妊娠者[11]，推測(cè)kisspeptin水平異常與胎盤功能不良相關(guān)，結(jié)合以往研究推測(cè)低水平kisspeptin、kiss1r與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)。

本研究顯示，kisspeptin、kiss1r陰性表達(dá)者LH水平升高，PRL、E2及P水平降低，表明kisspeptin、kiss1r表達(dá)與性激素水平有關(guān)。PRL為早期妊娠啟動(dòng)的主要激素，其水平的降低預(yù)示著排卵障礙、先兆性流產(chǎn)[12]。此外PRL降低至5 ng/mL以下則導(dǎo)致流產(chǎn)、胎兒死亡[13]。PRL水平降低影響卵巢功能，因此E2水平降低，而血清中LH水平升高，其原因可能與PRL、E2及P對(duì)垂體的反饋調(diào)控有關(guān)。以上結(jié)果提示kisspeptin、kiss1r表達(dá)異?？赡軙?huì)導(dǎo)致患者性激素水平的異常。

滋養(yǎng)細(xì)胞成功浸潤(rùn)到子宮組織并順利著床在妊娠過程中十分重要，這一過程涉及細(xì)胞遷移、侵襲，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲相似。有研究顯示滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力降低會(huì)導(dǎo)致不良妊娠的發(fā)生[14-15]。本研究顯示kiss1r轉(zhuǎn)染組細(xì)胞菌落數(shù)量、細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量均升高，說明kiss1r與絨癌細(xì)胞的侵襲、遷移密切相關(guān)。MMP-2、MMP-9可完全降解胞外基質(zhì)，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)，是調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的重要因子。呂珊珊等[16]研究顯示MMP-9在妊娠7～11周達(dá)到高峰，說明MMP-9水平可能與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力有關(guān)。JIANG等[17]建立MMP-9缺失型小鼠模型發(fā)現(xiàn)小鼠先兆性流產(chǎn)率較高。本研究顯示kiss1r轉(zhuǎn)染組MMP-2、MMP-9表達(dá)降低，提示MMP-2、MMP-9可影響滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步提示kiss1r基因可能通過影響MMP-2、MMP-9促侵襲基因的表達(dá)，使滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力出現(xiàn)異常調(diào)控，導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。

綜上所述，kisspeptin、kiss1r在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中呈低表達(dá)，促進(jìn)絨癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)，但其具體作用機(jī)制至今尚未闡明，因此kisspeptin、kiss1r在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的作用機(jī)制還有待深入研究。