楊傳來,李巧巧,夏任蘭,孫興偉

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院,江蘇蘇州 215004)

膀胱癌是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率居我國泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤第一位[1]。膀胱癌的病因較復(fù)雜，既有遺傳因素，又有外界環(huán)境的影響，其中吸煙[2]和芳香胺類化學(xué)物質(zhì)[3]是膀胱癌的誘因。臨床治療膀胱癌的標(biāo)準(zhǔn)是膀胱切除術(shù)配合化療與放療，但術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍較高[4]。一旦膀胱癌出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其2年病死率極高。神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)下調(diào)因子4(NEDD4)是一種E3泛素連接酶，其主要下游靶蛋白包括PTEN[5]、p53[6]、p73[6]、LATS1[7]、VEGFR2[8]等。研究[9]表明，NEDD4在人類癌癥發(fā)生和惡性進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，NEDD4在胰腺癌[10]、乳腺癌[11]、結(jié)直腸癌[12]和膀胱癌[13]中均呈高表達(dá)。盡管NEDD4在多數(shù)腫瘤中呈高表達(dá)并能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，然而其在膀胱癌中的研究較少。2019年1月，我們探討了NEDD4基因沉默對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌細(xì)胞T24和RT4購自American Type CultureCollection(ATCC)。MTT購自Sigma公司(USA)。Lipofectamine 2000、TRIzol購自Invitrogen公司(USA)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司(USA)。SYBR green PCR master mix購自Applied Biosystems公司(USA)?？筎ubulin單克隆抗體購自Sigma公司?？筃EDD4抗體購自Cell Signaling Technology公司(USA)。靶向NEDD4的siRNA(NEDD4siRNA-1、NEDD4siRNA-2、NEDD4siRNA-3)由蘇州吉瑪基因公司合成。實(shí)時(shí)RT-PCR引物由蘇州金唯智生物有限公司合成；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 靶向NEDD4的siRNA合成 NEDD4siRNA-1正向引物：5′-CCUAACAGAUGCUGAGAAUTT-3′，反向引物：5′-AUUCUCAGCAUCUGUUAGGTT-3′；NEDD4siRNA-2正向引物：5′-GCAAGGAUUCCUUCCUAAATT-3′，反向引物：5′-UUUAGGAAGGAAUCCUUGCTT-3′；NEDD4siR-NA-3正向引物：5′-GGAGAAUUAUGGGUGUCAATT-3′，反向引物：5′-UUGACACCCAUAAUUCUCCTT-3′。同時(shí)合成Negitive Control siRNA作為陰性對(duì)照，正向引物：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反向引物：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。每組siRNA用DEPC水溶解，并稀釋成濃度為20 μmol/L的溶液，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及siRNA轉(zhuǎn)染 人膀胱癌細(xì)胞T24和RT4常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/mL雙抗的DMEM培養(yǎng)基中并置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d用0.25%胰酶消化、傳代。轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度約70%時(shí)換無雙抗、無血清的DMEM培養(yǎng)基。設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，參照Lipofectamine 2000說明書的操作步驟和量將NEDD4siRNA-1、NEDD4siRNA-2、NEDD4siRNA-3、Negitive Control siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，空白對(duì)照組為野生型T24和RT4細(xì)胞，不予轉(zhuǎn)染；陰性對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染Negative Control siRNA，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染NEDD4siRNA-2。轉(zhuǎn)染4 h后更換為含有10%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后提取細(xì)胞RNA和蛋白質(zhì)。

1.4 NEDD4的mRNA和蛋白表達(dá)檢測 采用RT-PCR法和Western blotting法。收集轉(zhuǎn)染后的T24和RT4細(xì)胞，用TRIzol試劑法提取各組細(xì)胞的總RNA，并利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。隨后以此cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR，根據(jù)人NEDD4基因和內(nèi)參GAPDH基因設(shè)計(jì)引物為NEDD4：正向引物5′-GAAGATCTACCATGGCAGCCGACGACACTGAG-3′,反向引物：5′-CGGAATTCT CAATCAACCCCATCAAAGCCCTG-3′；GAPDH：正向引物5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′,反向引物：5′-CAGTGAGCT TCCCGTTCAG- 3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s；58 ℃ 20 s；70 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。各組重復(fù)檢測3次，以2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量。消化收集轉(zhuǎn)染后的T24和RT4細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，用10%的SDS-PAGE膠將提取的40 μg總蛋白進(jìn)行電泳分離，然后半干法轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉1 h，加入1∶1 000的抗Tubulin和NEDD4的一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，第2天將膜取出用TBST液洗滌3次后孵育羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h后用TBST液洗滌3次。將ECL顯影液的A液與B液按照1∶1混合。并反復(fù)滴加到NC膜上，將膠片放在NC膜上，緊扣暗匣子，用洗片機(jī)對(duì)其顯影。用Image J軟件分析蛋白電泳條帶灰度值，并計(jì)算NEDD4蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞增殖率測算 采用MTT法。收集對(duì)數(shù)生長期的T24和RT4細(xì)胞，稀釋成密度為6×104/mL的細(xì)胞懸液，各取100 μL接種于96孔板中。24 h后當(dāng)細(xì)胞融合度約70%時(shí)換無雙抗、無血清的DMEM培養(yǎng)基。設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，參照Lipofectamine 2000說明書的操作步驟和量將siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，空白對(duì)照組為野生型T24和RT4細(xì)胞，不予轉(zhuǎn)染；陰性對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染Negative Control siRNA，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染NEDD4siRNA-2。轉(zhuǎn)染4 h后更換為含有10%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h或72 h。每孔加入MTT 20 μL，混勻，再繼續(xù)孵育4 h，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，充分混勻后用酶標(biāo)儀檢測490 nm 波長處吸光度值。每組設(shè)置3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞遷移率測算 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照組為野生型T24和RT4細(xì)胞，不予轉(zhuǎn)染；陰性對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染Negative Control siRNA，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染NEDD4siRNA-2。將轉(zhuǎn)染后的T24和RT4細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)并以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，每組設(shè)置3個(gè)平行孔。劃痕后0和20 h分別觀察拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=(1-20 h時(shí)劃痕寬度/初始劃痕寬度)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照組為野生型T24和RT4細(xì)胞，不予轉(zhuǎn)染；陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染Negative Control siRNA，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染NEDD4siRNA-2。胰酶消化轉(zhuǎn)染后的T24和RT4細(xì)胞，低速離心。用無血清培養(yǎng)基重懸，并稀釋至1×105/mL，取200 μL細(xì)胞加入到Transwell上層小室，并在下層小室內(nèi)加入500 μL含有10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。將帶有Transwell小室的24孔板置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。20 h后取出培養(yǎng)板，吸棄上室內(nèi)培養(yǎng)基，用棉簽小心擦去上表面未侵襲的細(xì)胞和Matrigel，用眼科剪和鑷子剪取基底膜，置于新的24孔板內(nèi)，用PBS小心沖洗1次，侵襲的細(xì)胞用吉姆薩染液染色并用OLYMPUS生物智能導(dǎo)航儀拍照，隨機(jī)選取6個(gè)不同視野進(jìn)行細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 NEDD4蛋白及其下游靶蛋白PTEN和p73表達(dá)檢測 取T24和RT4細(xì)胞，設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照組為野生型T24和RT4細(xì)胞，不予轉(zhuǎn)染；陰性對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染Negative Control siRNA，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染NEDD4siRNA-2。轉(zhuǎn)染48 h后提取蛋白質(zhì)，消化收集轉(zhuǎn)染后的T24和RT4細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白濃度，用10%的SDS-PAGE膠將提取的40 μg總蛋白進(jìn)行電泳分離，然后半干法轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉1 h，加入1∶1 000的抗Tubulin、NEDD4、PTEN和p73的一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，第2天將膜取出，用TBST液洗滌3次，孵育羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h后用TBST液洗滌3次。將ECL顯影液的A液與B液按1∶1混合。并反復(fù)滴加到NC膜上，將膠片放在NC膜上，緊扣暗匣子，用洗片機(jī)對(duì)其顯影。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，并計(jì)算NEDD4、PTEN和p73蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組NEDD4的mRNA和蛋白表達(dá)比較 三條靶向NEDD4的siRNA均能下調(diào)細(xì)胞內(nèi)NEDD4 mRNA和蛋白表達(dá)，其中siRNA-2片段干擾效率最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。在T24細(xì)胞中，陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組、NEDD4siRNA-1組、NEDD4siRNA-2組、NEDD4siRNA-3組NEDD4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.03±0.11、1.00±0.13、0.33±0.06、0.20±0.06、0.52±0.05，蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.08±0.04、1.00±0.05、0.51±0.07、0.15±0.02、0.33±0.03。在RT4細(xì)胞中，陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組、NEDD4siRNA-1組、NEDD4siRNA-2組、NEDD4siRNA-3組NEDD4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.97±0.07、1.00±0.11、0.39±0.03、0.30±0.07、0.65±0.08，蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.87±0.02、1.00±0.07、0.41±0.04、0.34±0.03、0.46±0.03。

2.2 各組細(xì)胞增殖率比較 T24細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h時(shí)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率分別為100.00%± 8.00%、96.67%± 3.22%、65.02%±5.03%，72 h時(shí)分別為100.00%±12.00%、92.12%±5.30%、41.33%±6.35%，與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率降低(P均<0.01)。RT4細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h時(shí)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率分別為100.00%±10.40%、91.04%± 6.25%、 64.98%±9.54%，72 h時(shí)分別為100.00%±15.12%、92.67%±5.51%、41.33%±10.02%，與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率降低(P均<0.01)。

2.3 各組細(xì)胞遷移率比較 轉(zhuǎn)染后20 h空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組T24細(xì)胞遷移率分別為76%±9%、71%±10%、31%±4%，RT4細(xì)胞遷移率分別為70%±4%、66%±4%、35%±2%，與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移率降低(P均<0.01)。

2.4 各組細(xì)胞侵襲能力比較 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組T24侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(48.67±3.06)、( 45.67±1.53)、(26.67±1.16)個(gè)/視野，RT4侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(60.33±3.06)、(56.33±2.86 )、(28.00±4.00)個(gè)/視野，與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)降低(P均<0.01)。

2.5 各組NEDD4蛋白及其下游靶蛋白PTEN和p73表達(dá)比較 空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組T24細(xì)胞中NEDD4蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.99±0.04、0.96±0.02、0.44 ±0.01，PTEN蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為 1.01±0.08、1.29±0.06、4.15±0.10，p73蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.99±0.04、1.08±0.05、3.97±0.06，與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組NEDD4蛋白及其下游靶蛋白PTEN和p73表達(dá)均增加(P均<0.001)。空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組RT4細(xì)胞中NEDD4蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.03、1.06±0.02、0.40 ±0.01，PTEN蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為 1.01±0.06、1.49±0.10、3.10±0.16，p73蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.03、1.20±0.03、1.86±0.04，與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組NEDD4蛋白及其下游靶蛋白PTEN和p73表達(dá)均增加(P均<0.001)。

3 討論

膀胱癌是我國高發(fā)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率占泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之首。病理上膀胱癌分為肌層浸潤性和非肌層浸潤性兩種，前者常采用的治療方案為膀胱切除術(shù)，后者多采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)，但膀胱癌術(shù)后的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率仍較高。因此，有必要深入了解膀胱癌發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲的分子機(jī)制。腫瘤的發(fā)生是一種多基因、多步驟、多因素的慢性復(fù)雜過程。研究[14]認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生是由于細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)發(fā)生紊亂，促癌基因表達(dá)增加，而抑癌基因表達(dá)下調(diào)或失活。腫瘤細(xì)胞最主要的特點(diǎn)就是增殖不受限制，最終侵襲其他細(xì)胞或組織。

NEDD4是一種重要的E3泛素連接酶，在結(jié)構(gòu)上，NEDD4由具有催化功能的C-端HECT結(jié)構(gòu)域和具有底物識(shí)別功能的N-端結(jié)構(gòu)域(包括一個(gè)C2結(jié)構(gòu)域和一系列WW結(jié)構(gòu)域)組成。近年研究發(fā)現(xiàn)，NEDD4在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要功能。NEDD4參與耐藥鼻咽癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]。研究表明,NEDD4在包括膀胱癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，然而其表達(dá)與腫瘤大小、分級(jí)及分期并無關(guān)聯(lián)。NEDD4主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和蛋白酶體中以泛素依賴性方式介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解，發(fā)揮生物學(xué)功能[16]。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，NEDD4能直接靶向泛素化降解PTEN，并以依賴沉默PTEN方式抑制異種移植瘤的生長。此外，NEDD還能通過靶向泛素化降解LATS1而抑制Hippo信號(hào)通路[7]。以上研究表明NEDD4在多數(shù)腫瘤中發(fā)揮腫瘤促進(jìn)功能，因此，靶向沉默NEDD4可能是治療人類癌癥的有效策略。

基于以上研究，我們推測NEDD4通過調(diào)控PTEN和p73表達(dá)參與膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTEN和p73蛋白表達(dá)隨NEDD4的沉默而上調(diào)，且能下調(diào)膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。此與我們之前的推測相符。

Ye等[9]提出，NEDD4是調(diào)控諸多腫瘤發(fā)生與惡性進(jìn)展的信號(hào)通路，是一個(gè)潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。本研究證實(shí)，沉默NEDD4通過上調(diào)其下游靶分子PTEN和p73蛋白而抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，NEDD4基因沉默能抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。