范俊梅，趙京卉，楊 佳，張志平，宋玉靖，郭慧敏，武學清*

（山西省婦幼保健院，1.生殖醫(yī)學中心；2.防保科；3.臨床檢驗中心，山西 太原 030013）

1 前 言

復發(fā)性流產(chǎn)和胚胎種植失敗的原因包括遺傳因素、解剖因素、內(nèi)分泌因素、感染因素、免疫紊亂和血栓前狀態(tài)等。有研究表明，免疫紊亂與復發(fā)性流產(chǎn)和胚胎植入失敗有關[1-2]，占病因的50%～60%。淋巴細胞亞群是反應人體免疫狀態(tài)的一項重要指標，可以在一定程度反應母體對胚胎的容受程度。

維生素D是人體必需的脂溶性維生素，從食物中獲取極其有限，主要經(jīng)皮膚在陽光紫外線照射下將7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)變而來。來自膳食和皮膚合成的維生素D不具有生物活性，需要經(jīng)過肝臟酶催化形成25羥維生素D（25[OH]D），是維生素D在血液中存在的主要形式，且比較穩(wěn)定。維生素D經(jīng)典作用是參與鈣穩(wěn)態(tài)和骨骼代謝，之外參與免疫調(diào)節(jié)和細胞增殖[2]。研究顯示維生素D缺乏與復發(fā)性流產(chǎn)和胚胎種植失敗相關[3]。本研究旨在探索維生素D和淋巴細胞亞群的相關性，為臨床治療提供依據(jù)。

2 對象與方法

2.1 資料來源

收集2018年1月～2018年12月山西省婦幼保健院生殖醫(yī)學中心有胚胎種植失敗史或(和)復發(fā)性流產(chǎn)史（≥2次），且要求病因?qū)W篩查的病例，排除內(nèi)分泌、感染、腫瘤和肝腎功能異常者。

2.2 化驗指標測定

2.2.1 25（OH）D的檢測

維生素D是否缺乏，通過測定25（OH）D來估計。本研究參考美國內(nèi)分泌協(xié)會推薦的標準：維生素D缺乏，25（OH）D ＜50 nmol/L（20 ng/ml）；維生素D不足，25（OH）D 50～75 nmol/L（20～30 ng/ml）。以50 nmol/L為界分為高、低水平組?？崭共杉? ml外周靜脈血于抗凝管中，3000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘，取上清液進行測定，根據(jù)瑞士羅氏電化學發(fā)光免疫分析儀Modular Analytics E 170 及配套25（OH）D試劑盒，按照說明進行操作。

2.2.2 淋巴細胞亞群檢測

空腹采集2 m l 外周靜脈血于抗凝管中，采用美國Beckman Coulter公司的三色淋巴細胞亞群分析試劑盒、熒光素標記抗體、配套溶血劑，按照說明處理樣本，通過FC 500型流式細胞儀測定,T細胞（CD3+CD19-）、CD4+T細胞（CD3+CD4+）、CD8+T細胞（CD3+CD8+）、NKT細胞（CD3+CD16+CD56+）、NK細胞（CD3-CD16+CD56+）、B細胞（CD3-CD19+），結(jié)果采用百分率的形式表示。

2.3 統(tǒng)計學分析

選取SPSS 24.0軟件，采用Spearman相關性分析探索維生素D和淋巴細胞亞群的相關性；Mann-Whitney U檢驗分析不同維生素D水平CD3+和NKT細胞的差異，以α=0.05為檢驗水準。一般資料采用均數(shù)±標準差或者中位數(shù)（四分位距）表示。

3 結(jié) 果

3.1 一般資料

本研究共納入病例521例，①年齡介于22～45歲之間，平均年齡為30.91 ± 0.17歲；②其中有胚胎種植失敗史的345例，復發(fā)性流產(chǎn)176例；③25（OH）D平均值為39.84±0.65 nmol/L，其中400例小于50 nmol/L，缺乏率為76.78%（400/521），不足率為21.11%（110/521）,充足率為2.11%(11/521)；④CD3+T細胞中位數(shù)為72.20(9.25)%，CD8+T細胞中位數(shù)為28.30(9.00)%，NKT細胞中位數(shù)為2.60(3.35)%，NK細胞中位數(shù)為13.80(8.80)%，B細胞中位數(shù)為11.70(5.55)%；⑤CD4+T細胞平均值為38.53±6.83%；⑥CD4+/CD8+中位數(shù)為1.36(0.65)。

3.2 25（OH）D和淋巴細胞亞群相關性分析

①25（OH）D與CD3+T淋巴細胞、NKT細胞Spearman相關系數(shù)分別為0.108（P=0.014）和-0.168(P=0.000)；②25（OH）D與CD4+、CD8+T細胞、CD4+/CD8+、NK細胞、B細胞Spearman相關系數(shù)分別為0.053（P=0.227）、0.022(P=0.622)、0.025（P=0.565）、-0.019(P=0.669) 和-0.030（P=0.448）。

3.3 不同25（OH）D水平CD3+ 和NKT細胞表達差異

CD3+T淋巴細胞在不同25（OH）D水平表達無差異（Z=-1.260，P=0.208），NKT淋巴細胞在不同25（OH）D水平表達有差異（Z=-2.580，P=0.010）。

4 討 論

維生素D缺乏在育齡期女性報道不一，缺乏率為20%-90%[4]，存在妊娠丟失的人群缺乏率為45%[5]。李陽等[6]報道非妊娠組25（OH）D缺乏率為84.3%，本研究缺乏率為76.78%。此外，體內(nèi)維生素D水平與季節(jié)、性別有關，本研究與國內(nèi)學者報道冬春季缺乏率76.90%接近，但高于夏秋季缺乏率56.80%[7]。與李陽等[6]研究中非妊娠組25（OH）D不足率為15.7%相比，本研究25（OH）D不足率21.11%更為突出，與范希景等[7]報道冬春季不足率19.70%接近，但本研究25（OH）D平均值相比更低，可能與研究納入人群有關。

NK細胞不表達CD3+、CD4+和CD19+，大多成熟NK細胞表達CD2+、CD16+和 CD56+，其在復發(fā)性流產(chǎn)患者中的作用備受關注[8]。NKT細胞是自然殺傷T細胞，最早于1984年被Hercend T等學者命名，該類細胞具有NK細胞和T細胞的功能，主要表現(xiàn)在三方面：白細胞分化抗原1d (CD1d)的限制性、T細胞受體基因表達的恒定性和細胞因子的高表達性，通過分泌IL-2、IL-4、IL-10和I FN-γ等細胞因子參與體內(nèi)抗移植排斥、抗感染和自身免疫疾病的調(diào)節(jié)[9]。有研究提示活化后的NKT細胞通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡影響母胎免疫[10]。臨床中一般以CD3+CD16+CD56+為志對NKT進行檢測[11]，NKT細胞過高過低都可能導致流產(chǎn)的發(fā)生[9-12]，但目前尚無備孕及妊娠期參考范圍。本研究提示25（OH）D與NKT細胞負相關，且在不同25（OH）D水平NK樣細胞表達有差異，提示在調(diào)節(jié)NKT細胞治療方案中，加入維生素D的監(jiān)測，可以起到積極作用。

CD3為T淋巴細胞成熟分化的標志，主要有CD4和CD8兩個亞群，成熟T細胞表達其一，參與體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)[13]。本研究顯示25（OH）D與CD3+T淋巴細胞正相關，但在不同25（OH）D水平表達無差異。25（OH）D與CD4+、CD8+T淋巴細胞、CD4+/CD8+、NK細胞、B淋巴細胞無相關性，可能與樣本量的限制有關。

總之，淋巴細胞亞群作為臨床評價個體免疫狀體的一項指標，對存在妊娠丟失和（或）胚胎種植失敗史的女性中有重要指導作用。重視不孕不育女性體內(nèi)維生素D的水平對于免疫調(diào)節(jié)有積極的作用。