史 磊 張耀勇 田愛霞

1.漯河市中心醫(yī)院(漯河醫(yī)專一附院)腫瘤內(nèi)科 (河南 漯河,462000);2.湖北文理學(xué)院附屬襄陽市中心醫(yī)院消化一科

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，病死率、死亡率均較高[1]。臨床用于肝癌化療藥物多為鉑類、蒽環(huán)類抗瘤藥 、喜樹堿等，但臨床觀察發(fā)現(xiàn)這些藥物化療效果不理想，并且藥物的毒副作用也限制了其應(yīng)用[2]。近年來，由于中藥提取物顯示對癌細胞具有較好殺傷作用，對機體正常細胞的低毒副作用而被應(yīng)用于臨床抗腫瘤的治療。華蟾毒精是蟾蜍科動物的干燥分泌物，主要由中華大蟾蜍、黑眶蟾蜍分泌。有研究發(fā)現(xiàn)華蟾毒精具有顯著的抗癌活性[3]，但是作用機制尚未完全明確。鑒于此，本實驗通過不同劑量華蟾毒精對人肝癌細胞珠HepG2的增殖、凋亡作用及其機制研究，為華蟾毒精用于肝癌治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株HepG2(中國科學(xué)院細胞庫)；華蟾毒精(青島捷世康生物科技有限公司)；胎牛血清、DMSO、RPMI1640 培養(yǎng)基(Gibco公司)；鼠抗人Caspase、Bcl-2、Bax、β-actin抗體(Santa Cruz公司)；Annexin V-PI 流式細胞檢測試劑盒(Invitrogen 公司)；MTT試劑盒(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 肝癌細胞株HepG2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液并加雙抗100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素，于37℃ 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 分組 取對數(shù)期HepG2細胞，以5×103個/孔接種于96孔板，24h后分為對照組和實驗組1、實驗組2、實驗組3，實驗組分別加入濃度為25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的華蟾毒精，對照組細胞只加等體積的生理鹽水，每組設(shè)4個復(fù)孔。

1.2.3 MTT法檢測各組肝癌HepG2細胞增殖抑制率 各組細胞培養(yǎng)24h、48h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl，震蕩培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4h，棄培養(yǎng)孔上清后每孔加DMSO 150μl，震蕩使充分溶解。酶標(biāo)儀測定570nm波長吸光度(OD值)，細胞增殖抑制率=(對照組OD值-各實驗組OD值)/對照組OD值×100%。

1.2.4 流式細胞儀檢測各組肝癌HepG2細胞凋亡率 各組細胞培養(yǎng)24h、48h后，分別制成單細胞懸液，離心棄上清，加入5μl碘化丙啶(PI)和5μl Annexin V-FITC，避光孵育5min，流式細胞儀上機檢測。Hoechst染色觀察肝癌細胞形態(tài)學(xué)改變。

1.2.5 熒光定量PCR檢測AKT、mTOR、Bcl-2、Bax 和Caspase-3 mRNA表達 各組細胞培養(yǎng)48h后Trizol法提取RNA，操作按試劑盒說明書進行。采用熒光定量PCR法檢測凋亡相關(guān)因子(Bcl-2、Bax、Caspase-3)，引物序列見表1。PCR擴增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 10s；95℃變性 5s，58℃ 退火30s，40個循環(huán)；95℃延伸15s；60℃退火1min。反應(yīng)完成后按公式 2-ΔΔCT計算各基因mRNA的相對表達量。

1.2.6 免疫印跡法檢測Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達 各組細胞培養(yǎng)48h后加入細胞裂解液，按蛋白提取試劑盒說明書方法提取總蛋白并采用BCA法測定蛋白含量?？偟鞍装疵侩娪究?5μl經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，然后用含5%脫脂奶粉的TBS封閉1h，PBST洗滌后分別加入一抗(PI3K、AKT、 Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體的按1∶500稀釋)，4℃ 孵育過夜，洗滌3次后加入二抗(按1∶1000稀釋)后室溫孵育1h，再次洗滌3次后加入ECL顯色液在暗室中顯影。晾干后應(yīng)用凝膠成像軟件系統(tǒng)掃描拍照后使用ImageJ軟件進行灰度分析，以Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示蛋白的相對表達量。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析處理數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析處理，組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝癌HepG2細胞增殖抑制率檢測結(jié)果 見圖1。結(jié)果表明：作用24h、48h后，實驗組1、實驗組2和實驗組3細胞增殖抑制率均顯著高于對照組(P<0.05)，且實驗組間兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，隨濃度的增加增殖抑制越明顯，實驗組3增殖抑制效果最佳，實驗組2次之。實驗組1、實驗組2和實驗組3細胞在48時增殖抑制率均顯著高于24h細胞增殖抑制率(P<0.05)，且隨作用時間延長細胞增殖抑制效果越明顯。

圖1 各組人肝癌細胞HepG2增殖抑制率檢測結(jié)果圖

2.2 各組肝癌HepG2細胞凋亡率檢測結(jié)果 見圖2。結(jié)果顯示：作用24h、48h后，實驗組1、實驗組2和實驗組3細胞凋亡率均顯著高于對照組，實驗組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨濃度增加細胞凋亡率邊增加，實驗組3凋亡率最高，實驗組2次之。實驗組1、實驗組2和實驗組3細胞隨作用時間延長細胞凋亡率升高，在48時凋亡率均顯著高于24h(P<0.05)，對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，Hoechst染色結(jié)果見插頁彩圖3。對照組細胞呈均勻藍色發(fā)光，而隨著華蟾毒精藥物濃度逐漸增大，各實驗組細胞形態(tài)學(xué)變化也逐漸加重。

圖2 各組人肝癌細胞HepG2凋亡率檢測結(jié)果

2.3 各組肝癌HepG2細胞AKT、mTOR mRNA表達檢測 作用48h后，熒光定量PCR檢測各組HepG2細胞 AKT、mTOR mRNA表達結(jié)果。與對照組相比，實驗組1、實驗組2和實驗組3細胞AKT、mTOR mRNA表達量均顯著降低(P<0.05)，且具有濃度依賴性。

表2 各組細胞AKT、mTOR mRNA相對表達量比較

與對照組比較，△P<0.05；與實驗組1比較，*P<0.05；與實驗組2比較，#P<0.05

2.4 各組肝癌HepG2細胞 Bcl-2、Bax、Caspase-3mRNA表達檢測 見圖4。結(jié)果顯示：作用48h后，與對照組相比，實驗組1、實驗組2和實驗組3細胞Bcl-2 mRNA表達量均顯著降低(P<0.05)，Bax和Caspase-3 mRNA表達量均顯著增加(P<0.05)，且具有濃度依賴性。

圖4 各組人肝癌細胞HepG2 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達圖

2.5 各組肝癌HepG2細胞 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達檢測 見圖5。結(jié)果顯示：作用48h后，與對照組相比，實驗組1、實驗組2和實驗組3細胞Bcl-2 蛋白表達量均顯著降低，Bax和Caspase-3 蛋白表達量均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同樣也具有濃度依賴性。

圖5 各組人肝癌細胞HepG2 Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達圖

3 討論

腫瘤細胞通過惡性增殖對機體造成傷害，其機制主要是生物周期發(fā)生紊亂，導(dǎo)致癌細胞增殖和凋亡異常，癌細胞無限惡性增殖無停止期[4]?，F(xiàn)在肝癌治療多以手術(shù)、放療和化療為主，手術(shù)治療對于癌癥終末期療效欠佳，放療過程中往往會損害周圍正常組織器官，化療由于化療藥物經(jīng)血液循環(huán)到全身而對正常細胞有傷害作用，且臨床上仍缺乏高效的化療藥物[5,6]。對原發(fā)性肝癌患者來說，目前臨床上常用的化療藥物效果均不甚理想，而探尋高效的藥物以抑制腫瘤生長，增強對腫瘤的控制能力意義重大。

本研究選取25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L 3個濃度華蟾毒精進行實驗，通過對細胞活性檢測，發(fā)現(xiàn)華蟾毒精可呈時間和濃度依賴性抑制肝癌HepG2細胞的增殖。通過檢測細胞凋亡率情況，證明華蟾毒精可以誘導(dǎo)肝癌HepG2細胞凋亡，隨著華蟾毒精濃度增加，其促凋亡效果越明顯。丁宇霜等研究華蟾毒精作用于人結(jié)腸癌細胞株發(fā)現(xiàn)[7]，該藥物抑制人結(jié)腸癌細胞增殖、促進凋亡，同時對促凋亡蛋白因子Bax、Caspase-3檢測mRNA和蛋白表達明顯增加，抗凋亡蛋白因子Bcl-2表達減少；華蟾毒精作用于細胞后，可以通過改變JNK、ERK和p38 MAPK 信號通路中與細胞凋亡相關(guān)的促凋亡蛋白因子Bax、Caspase 3和抗凋亡蛋白因子Bcl-2 、Survivin的表達使癌細胞增殖凋亡和生長周期發(fā)生變化。同時也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)華蟾毒精干擾癌細胞后會生成損傷細胞線粒體的H2O2，并降低膜電位，通過損害線粒體途徑促進細胞凋亡[8]。

AKT/mTOR信號通路在多種癌癥發(fā)生和發(fā)展中均發(fā)揮著重要的作用，該信號通路對Bax、Caspase-3和Bcl-2mRNA和蛋白的表達均具有調(diào)控作用，從而可增強惡性腫瘤細胞的促增殖和抗凋亡能力[9,10]。華蟾毒精對惡性腫瘤細胞AKT/mTOR信號通路的調(diào)控研究尚少，但是AKT、mTOR mRNA的相對表達量下調(diào)則意味著惡性腫瘤細胞的增殖能力減弱，相對應(yīng)地，促凋亡能力增強，進而達到抑制腫瘤增長的目的[11]。本研究實驗組AKT、mTOR mRNA表達均低于對照組，且3個實驗組AKT、mTOR mRNA的相對表達量均逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。據(jù)此分析推測，華蟾毒精很可能通過調(diào)控AKT/mTOR信號通路影響增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達來抑制人肝癌細胞株增殖和促凋亡。

此外，本研究結(jié)果中促凋亡蛋白因子Bax、Caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl-2表達，發(fā)現(xiàn)Bax、Caspase-3表達量顯著增加，Bcl-2表達顯著降低，并且蛋白因子Bax、Caspase-3和Bcl-2的表達對華蟾毒精呈濃度依賴性，與丁宇霜等學(xué)者研究結(jié)果一致[7]。細胞凋亡是十分復(fù)雜的過程，構(gòu)成多種凋亡途徑，表現(xiàn)出一些特征模式，因細胞所受刺激不同這些模式有所異同，但都要進入由半胱氨酸天冬氨酸物異性蛋白酶(Caspase)家族參與的共同通路，激活的Caspase-3是細胞線粒體通過細胞色素C途徑達到細胞凋亡途徑中的靶標(biāo)激活物，也是Caspase酶級聯(lián)反應(yīng)中最終效應(yīng)因子[12,13]。Bcl-2家族蛋白是調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要蛋白之一，主要通過與其他凋亡蛋白的協(xié)同發(fā)揮作用。Bcl-2家族蛋白可通過一系列反應(yīng)釋放凋亡因子，激活Caspase家族，從而促使細胞發(fā)生凋亡[14]。Bax屬于促凋亡因子，其發(fā)揮作用是通過被凋亡信號誘導(dǎo)，形成同源二聚物，激動開啟線粒體通透性，通過釋放凋亡前因子細胞色素C與Caspase結(jié)合形成凋亡小體而發(fā)生凋亡，Bcl-2可競爭性地與Bax蛋白結(jié)合，形成穩(wěn)定的Bax/Bcl-2異源二聚體，終止細胞凋亡的發(fā)生[15,16]。本研究中也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)華蟾毒精處理后肝癌細胞株Caspase-3活性增強，推測華蟾毒精作用后，增加了癌細胞膜死亡受體與Caspase家族前體蛋白結(jié)合敏感性，并加快 Caspase 級聯(lián)反應(yīng)的啟動和Caspase-3激活，導(dǎo)致細胞內(nèi)蛋白降解，從而促進細胞凋亡。

綜上所述，華蟾毒精能夠抑制肝癌細胞增殖，并促進細胞凋亡，其作用機制可能通過調(diào)控AKT/mTOR信號通路下調(diào)Bcl-2蛋白的表達，上調(diào)Bax、Caspase-3蛋白的表達抑制肝癌細胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。