陳楚穎 代曼云 徐港銘 華慧英 劉愛明

寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理藥理學(xué)系 (浙江 寧波， 315211)

α-萘異硫氰酸酯(ANIT)膽汁淤積模型是最經(jīng)典的肝內(nèi)膽汁淤積模型，病理機制清楚，建立方法成熟，常用于藥物保肝及利膽作用機制的研究[1，2]。石膽酸(LCA)膽汁淤積模型是較新的模型，近年來越來越廣泛用于研究藥物對膽汁淤積基因的誘導(dǎo)和調(diào)控等方面[3～5]，但該模型病理機制尚未完全清楚，建模方法也不完全一致。目前尚未見比較兩種模型生化、病理，及膽汁酸代謝排泄變化規(guī)律的報道。本研究擬在同樣的實驗條件下系統(tǒng)比較兩種模型的生化反應(yīng)、病理機制和膽汁酸調(diào)控模式的相同和不同點，為膽汁淤積性肝病的病理機制探討與藥物研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 ①動物：成年清潔級雄性健康小鼠20只，體重25 g±2 g，由寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證編號：SYSK(浙)2013-0191。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實驗。②藥物與試劑：LCA(Sigma)，ANIT(Sigma)，Trizol(Invitrogen，USA)，HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒，定量PCR試劑盒(北京康為世紀生物科技公司)，堿性磷酸酶(ALP)、總膽汁酸(TBA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等檢測試劑盒(寧波瑞源生物科技公司)。

1.2 分組與造模 ①LCA模型建立：取10只小鼠，隨機分為LCA對照組和LCA實驗組，各5只。LCA對照組小鼠以玉米油灌胃；LCA實驗組小鼠以LCA-玉米油溶液灌胃(即先按15g/L濃度將LCA溶于玉米油，然后以300mg/kg/d的劑量灌胃)。灌胃體積均為0.1ml/10g，2次/d。第5次給藥12h后處死小鼠并取材。②ANIT模型建立：取10只小鼠，隨機分為ANIT對照組和ANIT實驗組，各5只。ANIT對照組小鼠以玉米油單次灌胃；ANIT實驗組小鼠以ANIT-玉米油灌胃(即先以7.5g/L濃度將ANIT溶于玉米油，然后以75mg/kg劑量單次灌胃)。灌胃體積均為0.1ml/10g，灌胃48h后處死小鼠。

1.3 膽汁酸代謝轉(zhuǎn)運基因的轉(zhuǎn)錄分析

1.3.1 總RNA提取 稱取20 mg肝臟組織加入100 μl Trizol勻漿，加入氯仿，離心分層，取30 μl上清液，加入等體積異丙醇沉淀RNA，75% 酒精洗滌兩次，DEPC水溶解，即提取總RNA。Nano Drop 2000測定吸光度(A)，做總RNA的純度以及濃度檢測，A260/280大于1.9的樣品用于實驗。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取1 μg總RNA，加入逆轉(zhuǎn)錄試劑dNTP Mix 4 μl，oligo (dT) Primer 2 μl，DDT 2 μl，HifiScript 1 μl，再加入RNase-Free Water補充逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系至20 μl體系，于PCR儀中反應(yīng)合成cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 定量PCR測定 反應(yīng)體系10 μl，其中包括：模版cDNA 1 μl，Master Mix 5 μl，上游引物0.2 μl，下游引物0.2 μl，DEPC水3.6 μl。PCR儀中95℃變性10 s、55℃退火10 s、72℃延伸15 s。反應(yīng)結(jié)束后，熒光定量PCR儀自動分析得到Cp值。其中，實驗中所設(shè)計的引物序列見表1，所有的引物序列均來源于引物數(shù)據(jù)庫(http://mouseprimerdepot.nci.nih.gov/)，并經(jīng)過溶解曲線分析驗證其專屬性。

將目標基因組平行樣的Cp值取平均數(shù)并計算樣本標準偏差STDEV與相對標準偏差rsd，用目標基因的Cp值分別減去同一樣本的內(nèi)參的Cp值得dCT，再用實驗組的dCT分別減去對照組dCT得到ddCT，取得Power值，并計算Power值平均值和標準偏差。

1.4 標本采集及保存 開始造模0、12、24、36 h通過尾靜脈采血50 μl，48 h后小鼠經(jīng)二氧化碳麻醉后，眼眶采血，血液收集于1.5 ml離心管中；經(jīng)4℃ 2000 r/min離心5 min后，取血清，轉(zhuǎn)移至-20℃保存。小鼠脫頸處死后，打開腹腔，充分暴露肝臟，取全部肝組織，稱重并記錄后，取一半肝大葉于10%中性福爾馬林溶液中固定，其余肝臟組織及時經(jīng)液氮速凍后，轉(zhuǎn)移至-80℃凍存。

1.5 血清生化指標檢測 按照試劑盒說明書的實驗方法，采用酶標儀分別測定ALP、TBA、AST、ALT。

1.6 肝臟組織病理學(xué)檢測 小鼠肝臟于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h后，梯度酒精脫水，石蠟包埋，4 μm常規(guī)切片，42℃攤片，蘇木素-伊紅染色后用樹脂膠封片，24 h后OLYMPUS CX31顯微鏡下放大40倍及400倍觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)變化。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0軟件包對生化結(jié)果及膽汁酸代謝基因表達結(jié)果進行處理，多組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠48h時生化指標結(jié)果 見表2。與LCA對照組相比，LCA實驗組小鼠ALP未見明顯變化，TBA升高28.6倍，ALT升高133.2倍，AST升高86.5倍。與ANIT對照組小鼠相比，ANIT實驗組小鼠ALP升高7.5倍，TBA升高30倍，ALT升高約28.8倍，AST升高23.5倍。LCA實驗組小鼠ALT和AST高于ANIT實驗組，顯示當前實驗劑量下，LCA實驗組小鼠肝細胞損傷較重；而ANIT實驗組小鼠ALP高于LCA實驗組，提示ANIT實驗組小鼠膽汁淤積較重。

2.2 兩實驗組小鼠4時間段各生化指標變化情況 見表3。從0～36h各生化指標動態(tài)變化結(jié)果顯示，ANIT實驗組小鼠ALP水平始終高于LCA實驗組；ANIT實驗組小鼠早期TBA水平高于LCA實驗組，24h后兩組小鼠TBA水平基本相當；而LCA實驗組小鼠ALT、AST水平始終高于ANIT實驗組，這提示ANIT主要損傷膽管系統(tǒng)，而LCA主要損傷肝細胞。

2.3 4組小鼠肝臟組織病理學(xué)情況 兩對照組小鼠肝臟大小、輪廓、顏色正常；肝組織鏡下病理觀察，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝竇呈放射狀排列，肝細胞核大而圓，核膜清晰，胞漿豐富且淡染(見插頁圖1A、E)。LCA實驗組小鼠肝臟壞死灶周圍肝細胞普遍水腫，細胞內(nèi)有大量空泡，胞核位于中央，壞死灶有大量炎細胞浸潤，主要為中性粒細胞，肝竇充血，膽小管輕度擴張(見插頁圖1B、C、D)。ANIT實驗組小鼠壞死灶周圍肝細胞輕度水腫，壞死灶中可見中性粒細胞，肝竇嚴重充血，膽小管明顯擴張(見插頁圖1F、G、H)。

表1 膽汁酸代謝轉(zhuǎn)運基因引物序列及產(chǎn)物

2.4 4組小鼠膽汁酸合成、攝取基因表達情況 見表4。Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1是最主要的參與膽汁酸合成的基因，對維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)具有重要作用[6]。與LCA對照組比較，LCA實驗組小鼠Cyp7a1降至0.1%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Cyp8b1降至0.7%，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而Cyp27a1在兩組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與ANIT對照組比較，ANIT實驗小鼠Cyp7a1降至1.5%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Cyp8b1降至5.5%，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而Cyp27a1在兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這提示LCA和ANIT對Cyp7a1、Cyp8b1基因表達可能是經(jīng)過核受體反饋性調(diào)節(jié)。

與LCA對照組比較，LCA實驗組小鼠肝臟膽汁酸攝取基因Oatp1降至32%、Oatp2降至46%、Nctp降至25%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；與ANIT對照組比較，ANIT實驗組小鼠肝臟Oatp1降至47%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而Oatp2、Nctp兩組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 4組小鼠膽汁酸排泄基因表達情況 見表5。Mdr2、Bsep是毛細膽管膜側(cè)轉(zhuǎn)運體的基因，與LCA對照組比較，LCA實驗組小鼠Mdr2升高158倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而Bsep在兩組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與ANIT對照組比較，ANIT實驗組小鼠Mdr2升高12.1倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Bsep升高4倍，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Mrp2、Mrp3、Mrp4、Ostb是血管側(cè)轉(zhuǎn)運體的基因,Mrp2、Mrp4在LCA對照組和實驗組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而LCA實驗組小鼠Mrp3較對照組升高3.3倍、Ostb升高202倍，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與ANIT對照組比較，ANIT實驗組小鼠Mrp3升高8倍、Mrp4升高6.5倍、Ostb升高200倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；而Mrp2在兩組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 4組小鼠PPARα靶基因表達情況 見表6。Acot1、Ehhadh、Cyp4a10是PPAR靶基因，在兩實驗組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示膽汁淤積所引起的細胞毒性并未導(dǎo)致基因表達的改變，上述膽汁酸代謝基因表達的變化是反饋性調(diào)控的結(jié)果。

表2 4組小鼠實驗48h時各生化指標結(jié)果比較

與同藥物對照組比較，**P<0.01；與LCA實驗組比較，△△P<0.01

表3 兩實驗組小鼠4時間段各生化指標結(jié)果比較

表4 4組小鼠膽汁酸合成、攝取基因表達比較

表5 4組小鼠膽汁酸排泄基因表達比較

表6 4組小鼠PPARα靶基因表達比較

3 討論

LCA是一種單羥基膽汁酸，是主要的膽汁酸成分之一，是肝毒性最強的單體膽汁酸[7]。正常時機體主要在肝臟降解LCA，從而維持LCA的低濃度，避免對機體造成損害。LCA誘導(dǎo)的膽汁淤積模型通過在短時間內(nèi)大劑量給予LCA，直接提升機體中的LCA負荷水平，通過其毒性作用造成膽汁淤積性肝損傷[8]。ANIT是一種可造成急性膽損傷的肝毒物，主要通過損傷小膽管上皮細胞，破壞其排泄功能，導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積，繼而導(dǎo)致局部與散在的肝細胞溶解性壞死，表現(xiàn)為血液中的膽紅素與轉(zhuǎn)氨酶水平顯著上升，常用于小鼠的肝臟膽汁淤積模型建立[9]。ANIT膽汁淤積模型的病理生理過程與臨床膽汁淤積的實際病理過程最為接近，實驗研究中也最為常用[10]。

從生化指標角度對比，兩種膽汁淤積模型變化趨勢基本一致，但變化倍數(shù)有所差異，可能與LCA及ANIT的使用劑量不同、給藥次數(shù)不同造成膽汁淤積的程度不同有關(guān)。通過對膽管損傷與肝細胞損傷標志性生化指標的動態(tài)監(jiān)測可見，ALP和TBA水平在ANIT模型中更早出現(xiàn)大幅升高，ALT與AST水平則在LCA模型中更早升高，這種毒性表現(xiàn)與ANIT作用于膽管上皮細胞的機制相符[11]，同時可推測LCA主要是對肝細胞造成損傷。

肝組織病理學(xué)結(jié)果表明，LCA實驗組小鼠肝細胞水腫嚴重，中性粒細胞浸潤量大，肝竇充血較輕，且膽小管輕度擴張，提示LCA可能影響肝細胞膜通透性并引起炎癥反應(yīng)。ANIT實驗組小鼠肝細胞水腫較輕微，少量中性粒細胞浸潤，肝竇嚴重淤血且有出血現(xiàn)象，膽小管嚴重擴張，符合ANIT造模機制中作用于膽管上皮細胞，肝竇嚴重淤血則由肝細胞受損、肝竇回流受阻引起[12]，提示LCA模型中主要損傷表現(xiàn)為肝細胞水腫和中性粒細胞浸潤，而ANIT模型中主要損傷肝竇和膽小管。

基因表達的結(jié)果提示，兩實驗組小鼠膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運、排泄基因變化趨勢基本一致，僅存在變化程度差異。合成攝取基因比較結(jié)果提示LCA和ANIT對膽汁酸攝取途徑的影響均較小；排泄基因比較結(jié)果提示，Mdr-2的變化在兩實驗組小鼠均存在。兩實驗組小鼠膽汁酸水平升高后反饋性調(diào)控膽汁酸合成、攝取和排泄基因的表達，努力維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)，變化的數(shù)量級差異可能是由于LCA本身是FXR等肝汁酸受體的強反饋因素，其反饋性調(diào)控的強度更大[13]。

兩種模型膽汁酸升高時間不同，提示其成模損傷機制不同，與經(jīng)典的ANIT模型相比，LCA模型中肝細胞損傷生化標志物首先升高，病理表現(xiàn)主要為肝細胞毒性。兩種工具藥物的造模機制不同，但膽汁酸代謝和轉(zhuǎn)運基因表達變化趨勢基本一致，說明兩種模型中基因變化更多是膽汁淤積升高后的反饋性調(diào)節(jié)的結(jié)果。這種強大的反饋性調(diào)控在實驗研究中可能會掩蓋干預(yù)因素所引起的調(diào)控效應(yīng)，因此，在膽汁淤積治療性或防護性機制研究中[14,15]，應(yīng)謹慎判斷其基因表達變化是反饋性調(diào)控的結(jié)果，還是治療防護因素的直接作用結(jié)果。