胡小唐，李?帥，胡春光，何程智, 3，高曉晴，韓夢(mèng)柯，馬國(guó)騰，李宏斌,，胡曉東

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蛋白質(zhì)力譜測(cè)試中生物分子鏈耦聯(lián)技術(shù)

胡小唐1, 2，李?帥1, 2，胡春光1, 2，何程智1, 2, 3，高曉晴1, 2，韓夢(mèng)柯1, 2，馬國(guó)騰1, 2，李宏斌1, 2,4，胡曉東1, 2

(1. 精密測(cè)試技術(shù)及儀器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津大學(xué))，天津 300072；2. 天津大學(xué)南昌微技術(shù)研究院，天津 300072；3. 北京軟物質(zhì)科學(xué)與工程高精尖創(chuàng)新中心(北京化工大學(xué))，北京 100029；4. 加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)化學(xué)系，溫哥華 V6T 1Z4)

蛋白質(zhì)力譜測(cè)試是研究生物學(xué)的重要組成部分．蛋白質(zhì)力譜測(cè)試的成功取決于兩大技術(shù)：一是分子尺度的力譜測(cè)量能力，即皮牛量級(jí)的力學(xué)分辨力和納米級(jí)別的空間分辨力；二是蛋白質(zhì)樣品制備能力，通過將微觀生物分子鏈與介觀微球/探針/基底耦聯(lián)，實(shí)現(xiàn)對(duì)分子尺度蛋白質(zhì)的有效測(cè)量．然而，蛋白質(zhì)樣品的耦聯(lián)情況很難在視覺上直接觀測(cè)，耦聯(lián)效果的好壞決定測(cè)試的成?。虼耍鞍踪|(zhì)樣品相關(guān)制備方法、耦聯(lián)工藝一直是單分子力譜測(cè)試中的研究重點(diǎn)．針對(duì)3種主要單分子力譜測(cè)試技術(shù)即光鑷、磁鑷及原子力顯微術(shù)對(duì)測(cè)試蛋白質(zhì)的需求特點(diǎn)，特別是對(duì)多分子鏈耦合樣品的測(cè)試需求特點(diǎn)，介紹了多種基于基底修飾、蛋白質(zhì)修飾和DNA鏈修飾的提高連接待測(cè)蛋白質(zhì)與DNA鏈/微球/探針/玻片/云母片的方法，分析了各自的優(yōu)缺點(diǎn)，并總結(jié)了典型的應(yīng)用，為相關(guān)領(lǐng)域中樣品的制備提供參考方案．

蛋白質(zhì)力譜；光鑷；磁鑷；原子力顯微術(shù)；耦聯(lián)

生物學(xué)是研究生命現(xiàn)象和生物活動(dòng)規(guī)律的科學(xué)，包括肌肉收縮、物質(zhì)輸運(yùn)、細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制等生命體的活動(dòng)，都是與分子馬達(dá)的推動(dòng)息息相關(guān)的．而單分子力譜是研究生物學(xué)的重要技術(shù)手段之一，例如細(xì)胞操控、分子馬達(dá)、DNA、蛋白質(zhì)折疊/解折疊等．在研究蛋白質(zhì)折疊/解折疊動(dòng)力學(xué)特性過程中，具有代表性的單分子力譜技術(shù)中的光鑷[1-3]、磁鑷[4-5]以及原子力顯微術(shù)[6-8]在各自研究領(lǐng)域中發(fā)揮著優(yōu)勢(shì)．然而，三大技術(shù)在進(jìn)行蛋白質(zhì)力譜測(cè)試時(shí)也面臨一個(gè)共性問題，即蛋白質(zhì)樣品的耦聯(lián)效率低．由于待測(cè)的目標(biāo)蛋白通常都是納米級(jí)別，一方面視覺上無(wú)法直接看到，另一方面由于其尺寸小，在與DNA分子鏈或玻片/云母片基底進(jìn)行連接時(shí)難于判別其是否連接到分子鏈或基底上，使實(shí)驗(yàn)變得復(fù)雜化，增加了待測(cè)蛋白與測(cè)試系統(tǒng)連接的難度．

原子力顯微術(shù)系統(tǒng)中，待測(cè)的生物樣品通過探針以及玻片/云母片表面與蛋白的非特異性相互作用(物理吸附)進(jìn)行連接；磁鑷系統(tǒng)中，待測(cè)的目標(biāo)蛋白是通過兩條/一條DNA鏈間接連接或者經(jīng)過生物素及地高辛修飾后直接連接到磁球及玻片表面；常見的光鑷系統(tǒng)有兩類：?jiǎn)喂忤嚭碗p光鑷．其中單光鑷中的生物樣品與系統(tǒng)的連接構(gòu)型和磁鑷系統(tǒng)相似，都是將生物樣品一端連接在玻片上，另一端連接在微球表面；雙光鑷系統(tǒng)又分為光鑷和微針組成的和兩個(gè)光鑷組成的兩種，前者是通過微針先捕獲一個(gè)微球，將其送到光鑷中，然后微針再捕獲一個(gè)微球，而后者是通過雙光鑷分別捕獲一個(gè)微球，二者的共同點(diǎn)是均要捕獲兩個(gè)微球，待測(cè)的生物樣品多數(shù)情況下是通過兩條/一條DNA鏈間接地連接到雙光鑷系統(tǒng)中的兩個(gè)聚苯乙烯/二氧化硅微球表面．然而在單分子力譜實(shí)驗(yàn)中，生物樣品的耦聯(lián)效果即待測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)與DNA鏈/玻片/云母片/探針的連接牢固程度將對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)效率起決定性的作用．

早期研究者們?cè)诶脝畏肿恿ψV技術(shù)研究DNA時(shí)，通過在DNA的兩端分別修飾生物素和地高辛、借助生物素和地高辛分別與聚苯乙烯/二氧化硅/磁球表面修飾的鏈霉親和素和地高辛抗體間的反應(yīng)將DNA連接在測(cè)試系統(tǒng)中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，耦聯(lián)效果理想．隨著單分子力譜技術(shù)的適用范圍不斷擴(kuò)大，當(dāng)應(yīng)用其研究蛋白質(zhì)折疊/解折疊時(shí)，多數(shù)借助待測(cè)蛋白與兩條DNA鏈所形成的二硫鍵及DNA鏈與微球表面的鏈霉親和素或地高辛抗體作用將待測(cè)蛋白連接在測(cè)試系統(tǒng)中，但是此方法產(chǎn)率較低，筆者小組的產(chǎn)率在5%左右，而且此方法通常需要室溫下過夜反應(yīng)，這對(duì)許多在室溫下并不是特別穩(wěn)定的蛋白質(zhì)是非常不利的．其次，在反應(yīng)過程中蛋白質(zhì)上的巰基之間或DNA上的巰基之間也會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)形成二硫鍵，生成蛋白-S-S-蛋白或者DNA-S-S-DNA這樣的副產(chǎn)物．而且由于蛋白質(zhì)尺寸通常很小，DNA-S-S-DNA與DNA-S-S-蛋白-S-S-DNA 在尺寸上很難區(qū)分，使后續(xù)實(shí)驗(yàn)變得更加復(fù)雜．再次，由于兩種DNA分子(Biotin和Digoxigenin修飾)同時(shí)與蛋白質(zhì)反應(yīng)，通過此方法制備的蛋白-DNA嵌合體產(chǎn)物中除了理想產(chǎn)物Biotin-DNA-蛋白-DNA-Digoxigenin外，還會(huì)存在Biotin-DNA-蛋白-DNA-Biotin和Digoxigenin-DNA-蛋白-DNA-Digoxigenin兩種副產(chǎn)物，無(wú)法用于光鑷實(shí)驗(yàn)．為了提高樣品產(chǎn)率，后期有研究者改為利用一條DNA鏈將待測(cè)蛋白連接在測(cè)試系統(tǒng)或者將待測(cè)蛋白不通過DNA鏈作用直接連接在測(cè)試系統(tǒng)中．但相比于利用兩條DNA鏈的情況，這會(huì)出現(xiàn)激光輻射熱會(huì)使待測(cè)蛋白變性的可能性增大的弊端．為進(jìn)一步提高耦聯(lián)效率，研究者們不斷嘗試新方法，如對(duì)待測(cè)蛋白進(jìn)行各種標(biāo)簽修飾、巰基修飾等以更牢固地將其連接在測(cè)試系統(tǒng)中．總結(jié)研究者們使用的修飾方法，主要包含三大類：第一類是基底(二氧化硅/聚苯乙烯微球、磁球及玻片/云母片)修飾；第二類是蛋白質(zhì)修飾；第三類是DNA鏈修飾．

1?修飾方法

1.1?基底修飾

在單分子力譜實(shí)驗(yàn)中，基底修飾可分為兩種．一種是二氧化硅、聚苯乙烯微球以及磁球修飾，通常情況是在這3種材質(zhì)微球表面包被地高辛抗體或者鏈霉親和素，借助生物素-鏈霉親和素間的特異性相互作用以及地高辛-地高辛抗體間的抗原-抗體反應(yīng)將微球與待測(cè)蛋白質(zhì)或DNA鏈連接．除此之外，也有通過在二氧化硅微球表面經(jīng)過一系列反應(yīng)修飾上巰基，借助微球表面的巰基與待測(cè)蛋白表面的巰基所形成的二硫鍵將微球與待測(cè)蛋白連接．另一種是對(duì)玻片/云母片基底修飾，可分為兩大類：一類為硅烷氨基化處理，氨基化處理后的基底可通過雙官能團(tuán)化學(xué)試劑Maleimide-PEG-Biotin使得基底表面帶有生物素，用于與表面修飾有鏈霉親和素的待測(cè)蛋白反應(yīng)進(jìn)而將待測(cè)蛋白連接在基底表面；氨基化處理后的基底也可通過雙官能團(tuán)化學(xué)試劑Maleimide-PEG-NHS使得基底表面帶有Maleimide基團(tuán)，通過Maleimide將表面帶有半胱氨酸殘基的待測(cè)蛋白連接在基底表面；或者通過Maleimide與帶有巰基的輔酶CoA反應(yīng)，借助CoA與待測(cè)蛋白表面修飾的ybbR標(biāo)簽間的相互作用將待測(cè)蛋白連接在基底表面；也可通過Maleimide與雙官能團(tuán)試劑SH-PEG4-chloroalkane反應(yīng)，進(jìn)而將HaloTag Ligand連接在基底表面，用于與表面修飾有HaloTag標(biāo)簽的待測(cè)蛋白相連接．另一類為硅烷羧基化處理，羧基化處理后的基底可通過雙官能團(tuán)試劑BD-PEG-NH2將表面修飾有hAGT (SNAP)tag標(biāo)簽的待測(cè)蛋白連接在基底表面．

1.2?蛋白質(zhì)修飾

為了研究蛋白質(zhì)的特性，通常需要在待測(cè)蛋白表面做一些修飾進(jìn)而將待測(cè)蛋白與測(cè)試系統(tǒng)相連接．修飾方法主要分為3種.

1) 蛋白修飾巰基

通常情況下，由于自身帶有巰基的待測(cè)蛋白比較少，所以通過基因合成的手段在待測(cè)蛋白表面修飾半胱氨酸殘基，借助半胱氨酸殘基帶有的巰基或待測(cè)蛋白自身帶有的巰基與微球或基底表面或DNA鏈上帶有的巰基所形成的二硫鍵將待測(cè)蛋白與微球或基底相連接．

2) 蛋白修飾標(biāo)簽蛋白

標(biāo)簽蛋白是指在表達(dá)待測(cè)蛋白時(shí)在其表面共同表達(dá)的特定蛋白用于與測(cè)試系統(tǒng)相連接，在使用的標(biāo)簽蛋白中，最常見的是Spytag、hAGT(SNAP)tag、ybbR tag及HaloTag 4種．Spytag是通過在待測(cè)蛋白表面修飾上Spytag標(biāo)簽，借助Spytag與SpyCatcher兩者間反應(yīng)形成的酰胺鍵將待測(cè)蛋白與DNA鏈或基底相連接；hAGT tag是通過在待測(cè)蛋白表面修飾上hAGT tag標(biāo)簽，借助hAGT tag與BG-PEG-amino間的相互作用將待測(cè)蛋白與基底相連接；ybbR tag是通過在待測(cè)蛋白表面修飾上ybbR tag標(biāo)簽，在SFP催化轉(zhuǎn)移酶的作用下將待測(cè)蛋白與基底連接；HaloTag是通過在待測(cè)蛋白表面修飾上HaloTag標(biāo)簽，借助HaloTag與HaloTag Ligand間的相互作用將待測(cè)蛋白與基底連接．

3)蛋白修飾生物素或鏈霉親和素

生物素與鏈霉親和素間的相互作用是常見的最穩(wěn)定的非共價(jià)鍵相互作用，表面修飾生物素是通過基因合成技術(shù)在待測(cè)蛋白表面修飾有生物素，借助生物素與微球或基底表面修飾的鏈霉親和素間的特異性反應(yīng)將待測(cè)蛋白與微球或基底連接；表面修飾鏈霉親和素是通過基因合成技術(shù)在待測(cè)蛋白表面修飾有鏈霉親和素，借助鏈霉親和素與基底或探針表面修飾的生物素間的特異性反應(yīng)將待測(cè)蛋白與基底或探針連接．

1.3?DNA鏈修飾

在單純研究DNA鏈的特性時(shí)，僅需在DNA鏈的一端修飾生物素另一端修飾地高辛，借助生物素-鏈霉親和素、地高辛-地高辛抗體間的相互作用將待測(cè)DNA鏈與微球或基底連接；在將DNA鏈作為待測(cè)蛋白的連接把手時(shí)，通常是在DNA鏈的一端修飾生物素或地高辛，另一端修飾巰基或氨基，借助巰基與待測(cè)蛋白表面的巰基所形成的二硫鍵、生物素或地高辛與微球表面的鏈霉親和素或地高辛抗體間的相互作用將待測(cè)蛋白與微球連接；還有一種情況是通過在寡核苷酸一端修飾疊氮化物后，對(duì)經(jīng)過DBCO激活后的待測(cè)蛋白進(jìn)行定點(diǎn)敲擊反應(yīng)，通過寡核苷酸將待測(cè)蛋白與DNA鏈連接，進(jìn)而間接地連接到微球表面．

總結(jié)以上3種修飾方法，做出示意圖如圖1所示.

圖1?修飾方法

2?應(yīng)?用

2.1?原子力顯微術(shù)測(cè)試系統(tǒng)

早期在用原子力顯微術(shù)系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)折疊/解折疊的實(shí)驗(yàn)中，是借助待測(cè)蛋白與探針和玻片基底的物理吸附力將待測(cè)蛋白連接在測(cè)試系統(tǒng)中，然而由于吸附力小，蛋白容易與探針或玻片脫落，極大地降低了實(shí)驗(yàn)效率．因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，研究者們不斷嘗試新方法來(lái)提高待測(cè)蛋白與測(cè)試系統(tǒng)的連接牢固度進(jìn)而提高實(shí)驗(yàn)測(cè)試效率．

Los Georgyi等[9]于2008年首次提出借助HaloTag標(biāo)簽與不同HaloTag Ligand配體的相互結(jié)合作用研究細(xì)胞成像以及蛋白固化的方法，證明了HaloTag標(biāo)簽蛋白的有效性，為相關(guān)領(lǐng)域的研究者提供了一個(gè)新的方法．而后有研究者將該方法應(yīng)用于原子力顯微術(shù)系統(tǒng)中，即通過使用云母基底氨基化處理、待測(cè)蛋白HaloTag標(biāo)簽修飾及探針金修飾三步法，將待測(cè)蛋白(I27)4連接在云母基底表面，進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)的蛋白質(zhì)解折疊拉伸實(shí)驗(yàn)[10]，其原理及部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖2所示．

圖2(a)和(b)介紹了HaloTag標(biāo)簽法的全過程，即首先用APTES對(duì)云母基底進(jìn)行氨基化處理，再用一端帶有NHS另一端帶有巰基的SM(PEG)24將HaloTag Ligand連接在云母基底表面，通過待測(cè)蛋白(I27)4表面修飾的標(biāo)簽蛋白HaloTag與基底修飾的HaloTag Ligand間的相互作用將待測(cè)蛋白(I27)4連接在基底上；圖2(c)對(duì)應(yīng)的是蛋白質(zhì)拉伸實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，力譜曲線中的拐點(diǎn)代表蛋白質(zhì)的解折疊，通過蠕蟲鏈模型，可以擬合得到每個(gè)拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的輪廓長(zhǎng)度伸長(zhǎng)量，進(jìn)而得到解折疊力及對(duì)應(yīng)的伸長(zhǎng)量關(guān)系．

在使用HaloTag標(biāo)簽法實(shí)現(xiàn)提高待測(cè)蛋白與測(cè)試系統(tǒng)的連接牢固度的同時(shí)，也有不同的課題組結(jié)合自己研究需要進(jìn)行不斷的探索和嘗試．Yin等[11]的ybbR標(biāo)簽法是借助SFP催化轉(zhuǎn)移酶的催化作用將帶有ybbR標(biāo)簽的待測(cè)蛋白與不同結(jié)構(gòu)的小分子化合物連接，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ybbR標(biāo)簽法的靈活性及高效性．Zakeri等[12]提出Spytag-SpyCatcher標(biāo)簽法，用于將兩種蛋白質(zhì)連接在一起，并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Spytag-SpyCatcher在不同溫度、pH、液體環(huán)境下的穩(wěn)定性，最后將該種方法應(yīng)用于原子力顯微術(shù)系統(tǒng)中，通過解折疊力的大小驗(yàn)證了Spytag-SpyCatcher結(jié)合的牢固度．Pippig等[13]通過在待測(cè)綠色熒光蛋白GFP表面分別修飾ybb Rtag標(biāo)簽及GCN4肽鍵鏈，在FP催化轉(zhuǎn)移酶的作用下將待測(cè)蛋白與一端修飾有輔酶CoA的DNA單鏈借助CoA與ybbR所形成的共價(jià)鍵將蛋白與DNA單鏈連接，并將該方法用于原子力顯微術(shù)系統(tǒng)中，驗(yàn)證了該方法可用于探針轉(zhuǎn)移單分子實(shí)驗(yàn)，為DNA折紙技術(shù)及分子自組裝提供有效手段，其原理[13]如圖3所示．

圖2?HaloTag標(biāo)簽法原理及部分?jǐn)?shù)據(jù)

圖3?ybbR標(biāo)簽法原理

通過在待測(cè)蛋白ddFLN4表面修飾鏈霉親和素mcSA2及ybbR標(biāo)簽蛋白，相應(yīng)地在探針表面通過PEG修飾輔酶CoA、在基底表面通過PEG修飾生物素，借助CoA與ybbR形成的共價(jià)鍵將待測(cè)蛋白與探針連接，借助待測(cè)蛋白表面的鏈霉親和素與基底表面的生物素的特異性反應(yīng)進(jìn)行拉伸實(shí)驗(yàn)或者在探針表面通過FIVAR修飾上生物素、在基底表面通過修飾CoA進(jìn)而將修飾有鏈霉親和素的待測(cè)蛋白ddFLN4連接在基底表面，借助探針上的生物素與基底表面的鏈霉親和素間的特異性反應(yīng)進(jìn)行拉伸實(shí)驗(yàn)，是應(yīng)用于原子力顯微術(shù)系統(tǒng)中通過對(duì)待測(cè)蛋白進(jìn)行標(biāo)簽修飾進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行拉伸實(shí)驗(yàn)的一種新方法[14]，其原理及部分?jǐn)?shù)據(jù)如圖4所示．

通過在待測(cè)蛋白表面修飾鏈霉親和素、在基底表面通過PEG作用修飾生物素Biotin，借助生物素和鏈霉親和素間的相互作用實(shí)現(xiàn)待測(cè)蛋白與系統(tǒng)的牢固連接．通過從鏈霉親和素的N端及C端拉伸待測(cè)蛋白質(zhì)ddFLN4所獲取的不同力譜曲線．以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明從鏈霉親和素不同端點(diǎn)拉伸待測(cè)蛋白所需要的拉伸速度不同，進(jìn)而所對(duì)應(yīng)的解折疊力和折疊力有所不同，說(shuō)明鏈霉親和素不同端點(diǎn)與待測(cè)蛋白的相互作用力有所不同．此外，上述數(shù)據(jù)表明利用鏈霉親和素標(biāo)簽法進(jìn)行生物樣品耦聯(lián)時(shí)，不管是從N端還是C端進(jìn)行連接，耦聯(lián)效果均非常好，從而驗(yàn)證了該耦聯(lián)方法的有效性．

綜觀應(yīng)用于原子力顯微術(shù)測(cè)試系統(tǒng)中的生物分子鏈耦聯(lián)技術(shù)，為提高待測(cè)蛋白與系統(tǒng)的連接牢固度，研究者們多采用對(duì)待測(cè)蛋白進(jìn)行標(biāo)簽修飾的方式，例如：HaloTag標(biāo)簽法，該方法可用于包含半胱氨酸的蛋白質(zhì)及帶有SNAP標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，而且在構(gòu)建重組蛋白過程中，HaloTag可提高表達(dá)級(jí)別及在大腸桿菌中的溶解性；ybbR標(biāo)簽法，該方法操作簡(jiǎn)單，成本較低；鏈霉親和素修飾法，該方法中的生物素鏈簡(jiǎn)單易制備，鏈霉親和素鏈穩(wěn)定可長(zhǎng)時(shí)間保持活性，從而可長(zhǎng)效用于反復(fù)的解折疊、折疊拉伸實(shí)驗(yàn)．以上各方法描述的都是對(duì)待測(cè)蛋白進(jìn)行修飾，然而為提高連接牢固度，還需在對(duì)待測(cè)蛋白修飾的基礎(chǔ)上，相應(yīng)地對(duì)玻片/云母片/探針進(jìn)行修飾以進(jìn)行特定的連接，修飾方法相對(duì)蛋白修飾比較簡(jiǎn)單，這里不再贅述．

2.2?磁鑷測(cè)試系統(tǒng)

在用磁鑷系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)折疊/解折疊的實(shí)驗(yàn)中，通常情況下待測(cè)蛋白是通過一條或兩條DNA鏈與玻片基底和磁球借助地高辛-地高辛抗體、生物素-鏈霉親和素間相互作用實(shí)現(xiàn)其與測(cè)試系統(tǒng)的連接．然而由于此種方法中待測(cè)蛋白與DNA鏈的連接效率非常低，因此探究新的連接方法顯得極為重要．

嚴(yán)潔課題組通過在待測(cè)蛋白的N端修飾HaloTag標(biāo)簽，C端修飾AviTag標(biāo)簽，N端通過HaloTag與玻片表面修飾的HaloTag 配體連接，C端通過AviTag與生物素反應(yīng)后再通過生物素-鏈霉親和素相互作用將待測(cè)蛋白間接地連接到表面修飾有鏈霉親和素的磁球表面[15-17]．Yoon課題組將二硫鍵連接法即借助待測(cè)蛋白與DNA鏈間形成的二硫鍵將待測(cè)蛋白連接在基底表面應(yīng)用于自己課題組的磁鑷系統(tǒng)中，先后研究了蛋白質(zhì)SNARE、GlpG在折疊/解折疊過程中的動(dòng)力學(xué)特性及能量改變信息[18-19]．在磁鑷系統(tǒng)中，使用Spytag-SpyCatcher標(biāo)簽法將待測(cè)蛋白GlpG表面修飾Spytag標(biāo)簽后與一端修飾生物素另一端通過核糖體修飾SpyCatcher及一端修飾地高辛、另一端通過核糖體修飾SpyCatcher的兩條DNA鏈連接在一起進(jìn)而間接將待測(cè)蛋白連在經(jīng)PEG修飾的玻片及鏈霉親和素包被的磁球表面進(jìn)行拉伸實(shí)驗(yàn)[20]，其原理如圖5所示．

在磁鑷系統(tǒng)中，使用二硫鍵連接法的操作簡(jiǎn)單但連接效率極低；HaloTag標(biāo)簽法通過在待測(cè)蛋白表面修飾HaloTag標(biāo)簽，對(duì)玻片基底修飾HaloTag 配體，借助二者間的相互作用實(shí)現(xiàn)待測(cè)蛋白與磁鑷系統(tǒng)的連接，該方法的連接效率大為提高；Spytag標(biāo)簽法在節(jié)省反應(yīng)時(shí)間及成本的同時(shí)，由于DNA鏈?zhǔn)沁B接在目標(biāo)蛋白的兩端(N端和C端)，所以也存在不能改變拉伸目標(biāo)蛋白的幾何形狀的問題．

圖5?Spytag-SpyCatcher標(biāo)簽法原理

2.3?光鑷測(cè)試系統(tǒng)

在用雙光鑷系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)折疊/解折疊實(shí)驗(yàn)中，待測(cè)蛋白往往是通過兩條或一條DNA鏈，借助待測(cè)蛋白與DNA鏈所形成的二硫鍵將待測(cè)蛋白間接連接到微球表面．

在待測(cè)蛋白表面修飾半胱氨酸殘基，借助殘基中的巰基與DNA鏈一端修飾的巰基所形成的二硫鍵將待測(cè)蛋白通過DNA鏈連接在微球表面，用于蛋白質(zhì)RNase H單體及多聚體的解折疊/折疊研究[21]．

Gebhardt等[22]在2010年將該種方法應(yīng)用于自己小組的雙光鑷系統(tǒng)中生物樣品的連接上，成功研究了包含有3個(gè)GCN4結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)LZ26GCN4的折疊/解折疊動(dòng)力學(xué)參數(shù)特性以及相應(yīng)的能量圖譜．

筆者小組也將該方法應(yīng)用于自己搭建的雙光鑷系統(tǒng)中，用于研究蛋白質(zhì)(NuG2)4的折疊/解折疊動(dòng)力學(xué)特性．實(shí)驗(yàn)中，待測(cè)蛋白(NuG2)4通過兩條不同長(zhǎng)度即400bp和800bp的DNA鏈連接在雙光阱所捕獲的表面分別包被有地高辛抗體和鏈霉親和素的聚苯乙烯微球上，通過在待測(cè)蛋白(NuG2)4兩端分別

修飾半胱氨酸，借助半胱氨酸與DNA鏈一端修飾的巰基所形成的二硫鍵將待測(cè)蛋白與DNA鏈進(jìn)行連接，借助DNA鏈另一端分別修飾的地高辛或生物素與微球連接．圖6是該種方法的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)．理想情況下待測(cè)蛋白(NuG2)4與兩條DNA鏈連接后的條帶應(yīng)該是在1200bp位置附近，然而圖6(a)的瓊脂糖凝膠電泳圖中該位置處的條帶特別淺，說(shuō)明該種方法的連接效率低，導(dǎo)致獲取圖6(b)蛋白質(zhì)(NuG2)4力譜曲線的效率特別低．

使用兩條DNA鏈連接待測(cè)蛋白方法的優(yōu)點(diǎn)是提高了空間分辨率，減少待測(cè)蛋白與微球間的非特異性相互作用，但缺點(diǎn)是連接效率低．

為了提高生物樣品的連接效率，Rief課題組在該種方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改變，即通過待測(cè)蛋白質(zhì)表面所修飾的半胱氨酸殘基與寡核苷酸鏈連接，然后借助蛋白質(zhì)表面的寡核苷酸鏈與雙鏈DNA一端所連接的寡核苷酸單鏈進(jìn)行雜化反應(yīng)，最終形成微球-雙鏈DNA(連有寡核苷酸單鏈)-待測(cè)蛋白(連有寡核苷酸單鏈)-雙鏈DNA(連有寡核苷酸單鏈)-微球結(jié)構(gòu)，借助該種方法，Rief組成功研究了蛋白質(zhì)Hsp70及Hsp90在折疊/解折疊過程中不同結(jié)合位點(diǎn)狀態(tài)變化所對(duì)應(yīng)的特性信息[23-24]．

圖6?二硫鍵連接法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

在光鑷系統(tǒng)中，使用Avi標(biāo)簽法的多為微球-待測(cè)蛋白-雙鏈DNA-微球結(jié)構(gòu)，通?？梢酝ㄟ^兩種方法來(lái)形成這種結(jié)構(gòu)．方法一為將經(jīng)過基因修飾表面帶有AviTag標(biāo)簽并經(jīng)過表達(dá)后表面連有生物素的待測(cè)蛋白直接與一端修飾有巰基另一端修飾有地高辛的雙鏈DNA反應(yīng)，通過待測(cè)蛋白與雙鏈DNA形成的二硫鍵將待測(cè)蛋白與DNA鏈連接在一起、通過微球表面的鏈霉親和素及地高辛抗體分別與待測(cè)蛋白表面的生物素及雙鏈DNA一端的地高辛反應(yīng)最終實(shí)現(xiàn)微球-待測(cè)蛋白-雙鏈DNA-微球結(jié)構(gòu)[25-27]；方法二為將一端修飾有巰基的DNA寡核苷酸鏈經(jīng)過DTDP活化后與經(jīng)過基因工程修飾后表面帶有生物素和巰基的待測(cè)蛋白反應(yīng)形成待測(cè)蛋白-寡核苷酸鏈的結(jié)構(gòu)，再將其與一端帶有寡核苷酸鏈另一端修飾有雙地高辛的雙鏈DNA進(jìn)行雜化反應(yīng)，最終形成帶有生物素的待測(cè)蛋白-帶有雙地高辛的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，通過生物素-鏈霉親和素、地高辛-地高辛抗體反應(yīng)將待測(cè)蛋白連在雙光阱中的兩個(gè)微球表面[28-30]．

通過一條DNA鏈將待測(cè)蛋白連接在微球表面即在待測(cè)蛋白的一端修飾生物素另一端修飾半胱氨酸，借助半胱氨酸上的巰基與DNA鏈一端修飾的巰基所形成的二硫鍵將待測(cè)蛋白與DNA鏈連接起來(lái)，而后通過待測(cè)蛋白一端修飾的生物素與微球表面的鏈霉親和素的特異性反應(yīng)、DNA鏈另一端修飾的地高辛與微球表面的地高辛抗體的抗原抗體反應(yīng)將待測(cè)蛋白連接在雙光鑷系統(tǒng)中，用于研究從不同方向拉伸卷曲蛋白GCN4的動(dòng)力學(xué)特性[31]．

綜觀光鑷系統(tǒng)中常用的生物分子鏈耦聯(lián)技術(shù)，使用兩條DNA鏈將待測(cè)蛋白連接在系統(tǒng)中的方法雖然操作簡(jiǎn)單，但是連接效率非常低；使用一條DNA鏈相比于使用兩條DNA鏈將待測(cè)蛋白連接在光鑷系統(tǒng)中，連接效率會(huì)有所提高，但缺點(diǎn)是降低了信噪比，同時(shí)激光照射樣品池所產(chǎn)生的熱效應(yīng)會(huì)使待測(cè)蛋白發(fā)生變性的可能性增大．

3?討?論

隨著研究者們不斷地深入研究，在用光鑷系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)的折疊/解折疊問題時(shí)，系統(tǒng)逐漸由單光鑷發(fā)展為雙光鑷，結(jié)合測(cè)試系統(tǒng)中樣品的連接構(gòu)型不同即單光鑷是通過捕獲一個(gè)微球借助DNA鏈的作用實(shí)現(xiàn)微球與待測(cè)蛋白一端的連接，待測(cè)蛋白的另一端通過DNA鏈連接在玻片表面；而雙光鑷系統(tǒng)是通過捕獲兩個(gè)微球，借助兩條DNA鏈的作用實(shí)現(xiàn)待測(cè)蛋白與微球的連接．但由于使用兩條DNA鏈連接待測(cè)蛋白的效率低，有研究者開始嘗試僅用一條DNA鏈連接待測(cè)蛋白，而待測(cè)蛋白的另一端直接與其中的一個(gè)微球連接，即借助DNA鏈的修飾和對(duì)待測(cè)蛋白進(jìn)行標(biāo)簽修飾等多種修飾方法相結(jié)合的方式實(shí)現(xiàn)生物樣品的耦聯(lián)，連接效率有所提高．應(yīng)用在光鑷系統(tǒng)中的生物樣品耦聯(lián)方法同樣適用于磁鑷系統(tǒng)中．在原子力顯微術(shù)系統(tǒng)中，結(jié)合不同待測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)也不斷地探索出新的玻片/云母片基底修飾及待測(cè)蛋白標(biāo)簽修飾方法，如鏈霉親和素修飾法，通過在待測(cè)蛋白表面修飾鏈霉親和素，在玻片基底修飾生物素，借助鏈霉親和素和生物素間的相互作用實(shí)現(xiàn)待測(cè)蛋白與玻片的連接，有效地改善了生物樣品與測(cè)試系統(tǒng)連接效率低的問題．本文介紹了應(yīng)用于單分子力譜技術(shù)中常見的3種修飾方法并分別列舉、總結(jié)了應(yīng)用于原子力顯微術(shù)、磁鑷及光鑷三大單分子力譜測(cè)試系統(tǒng)中的生物分子鏈耦聯(lián)的方法及各自的優(yōu)缺點(diǎn)．對(duì)于不同的測(cè)試系統(tǒng)，為了提高生物樣品的連接效率，多采取多種修飾方法相結(jié)合的方式，如表1所示．

表1?修飾方法對(duì)比

Tab.1?Comparison of the modification methods

4?結(jié)?語(yǔ)

在用光鑷、磁鑷及原子力顯微術(shù)三大技術(shù)研究蛋白質(zhì)折疊/解折疊實(shí)驗(yàn)中，待測(cè)蛋白與DNA鏈/探針/玻片/云母片/微球的連接牢固度直接影響著實(shí)驗(yàn)的成功率，因此探究一種高效的生物分子鏈耦聯(lián)技術(shù)是每一位相關(guān)領(lǐng)域研究者的目標(biāo)．本文提供了一個(gè)現(xiàn)有研究方法的基礎(chǔ)總結(jié)，希望在今后的科研中，可以探索更多更豐富更高效的生物樣品耦聯(lián)方法．

致?謝

在此特別感謝天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院尉遲之光老師在實(shí)驗(yàn)及論文撰寫過程中提供的幫助．

［1］ Jagannathan B，Marqusee S. Protein folding and unfolding under force[J]. Biopolymers，2013，99(11)：860-869.

［2］ Lei Hai，He Chengzhi，Hu Chunguang，et al. Single-molecule force spectroscopy trajectories of a single protein and its polyproteins are equivalent：A direct experimental validation based on a small protein NuG2[J]. Angewandte Chemie International Edition，2017，56(22)：6117-6121.

［3］ Ma Lu，Cai Yiying，Li Yanghui，et al. Single-molecule force spectroscopy of protein-membrane interactions [J]．ELife，2017，6：e30493.

［4］ Chen Hu，F(xiàn)u Hongxia，Zhu Xiaoying，et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA[J]. Biophysical Journal，2011，100(2)：517-523.

［5］ Long Xi，Parks Joseph W，Bagshaw Clive R，et al. Mechanical unfolding of human telomere G-quadruplex DNA probed by integrated fluorescence and magnetic tweezers spectroscopy[J]. Nucleic Acids Research，2013，41(4)：2746-2755.

［6］ Lee Whasil，Zeng Xiancheng，Zhou Huanxiang，et al. Full reconstruction of a vectorial protein folding pathway by atomic force microscopy and molecular dynamics simulations[J]. Journal of Biological Chemistry，2010，285(49)：38167-38172.

［7］ Li Hongbin，Oberhauser Andres F，F(xiàn)owler Susan B，et al. Atomic force microscopy reveals the mechanical design of a modular protein[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2000，97(12)：6527-6531.

［8］ Marszalek Piotr E，Dufrêne Yves F. Stretching single polysaccharides and proteins using atomic force microscopy[J]. Chemical Society Reviews，2012，41(9)：3523-3534.

［9］ Los Georgyi V，Encell Lance P，McDougall Mark G，et al. HaloTag：A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis[J]. ACS Chemical Biology，2008，3(6)：373-382.

［10］ Taniguchi Yukinori，Kawakami Masaru. Application of HaloTag protein to covalent immobilization of recombinant proteins for single molecule force spectroscopy[J]. Langmuir，2010，26(13)：10433-10436.

［11］ Yin Jun，Straight Paul D，McLoughlin Shaun M，et al. Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102(44)：15815-15820.

［12］ Zakeri Bijan，F(xiàn)ierer Jacob O，Celik Emrah，et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein，through engineering a bacterial adhesin[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2012，109(12)：4347-4348.

［13］ Pippig Diana A，Baumann Fabian，Strackharn Mathias，et al. Protein-DNA chimeras for nano assembly[J]. ACS Nano，2014，8(7)：6551-6555.

［14］ Bauer Magnus S，Milles Lukas F，Sedlak Steffen M，et al. Monomeric streptavidin：A versatile regenerative handle for force spectroscopy [EB/OL]. https:// www. biorxiv.org/content/early/2018/03/08/276444.fill. pd，2018.

［15］ Chen Hu，Chandrasekar Saranya，Sheetz Michael P，et al. Mechanical perturbation of filamin A immu-noglobulin repeats 20-21 reveals potential non-equilibrium mechanochemical partner binding function [J]. Scientific Reports，2013，3：1642.

［16］ Chen Hu，Yuan Guohua，Winardhi Ricksen S，et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces[J]. Journal of the American Chemical Society，2015，137(10)：3540-3546.

［17］ Chen Hu，Zhu Xiaoying，Cong Peiwen，et al. Differential mechanical stability of filamin A rod segments[J]. Biophysical Journal，2011，101(5)：1231-1237.

［18］ Min Duyoung，Jefferson Robert E，Bowie James U，et al. Mapping the energy landscape for second-stage folding of a single membrane protein[J]. Nature Chemical Biology，2015，11(12)：981.

［19］ Min Duyoung，Kim Kipom，Hyeon Changbong，et al. Mechanical unzipping and rezipping of a single SNARE complex reveals hysteresis as a force-generating mechanism[J]. Nature Communications，2013，4：1705.

［20］ Min Duyoung，Arbing Mark A，Jefferson Robert E，et al. A simple DNA handle attachment method for single molecule mechanical manipulation experiments[J]. Protein Science，2016，25(8)：1535-1544.

［21］ Cecconi Ciro，Shank Elizabeth A，Dahlquist Frederick W，et al. Protein-DNA chimeras for single molecule mechanical folding studies with the optical tweezers[J]. European Biophysics Journal，2008，37(6)：729-738.

［22］ Gebhardt J C M，Bornschl?gl T，Rief M，et al. Full distance-resolved folding energy landscape of one single protein molecule[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2010，107(5)：2013-2018.

［23］ Bauer Daniela，Merz Dale R，Pelz Benjamin，et al. Nucleotides regulate the mechanical hierarchy between subdomains of the nucleotide binding domain of the Hsp70 chaperone DnaK[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2015，112(33)：10389-10394.

［24］ Jahn Markus，Buchner Johannes，Hugel Thorsten，et al. Folding and assembly of the large molecular machine Hsp90 studied in single-molecule experiments [J]．Proceedings of the National Academy of Sciences，2016，113(5)：1232-1237.

［25］ Gao Ying，Zorman Sylvain，Gundersen Gregory，et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages[J]．Science，2012，337(6100)，1340-1343.

［26］ Jiao Junyi，Rebane Aleksander A，Ma Lu，et al. Kinetically coupled folding of a single HIV-1 glycoprotein 41 complex in viral membrane fusion and inhibition[J]．Proceedings of the National Academy of Sciences，2015，112(22)：E2855-E2864.

［27］ Zhang Yongli，Xi Zhiqun，Gao Ying，et al. Direct observation of helix staggering，sliding，and coiled coil misfolding[J]. Biophysical Journal，2012，102(3)：175a.

［28］ Stigler Johannes，Ziegler Fabian，Gieseke Anja，et al. The complex folding network of single calmodulin molecules[J]．Science，2011，334(6055)：512-516.

［29］ Woodside Michael T，Anthony Peter C，Behnke-Parks William M，et al. Direct measurement of the full，sequence-dependent folding landscape of a nucleic acid[J]. Science，2006，314(5801)：1001-1004.

［30］ ?oldák Gabriel，Stigler Johannes，Pelz Benjamin，et al. Ultrafast folding kinetics and cooperativity of villin headpiece in single-molecule force spectroscopy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2013，110(45)：18156-18161.

［31］ Gao Ying，Sirinakis George，Zhang Yongli. Highly anisotropic stability and folding kinetics of a single coiled coil protein under mechanical tension[J]. Journal of the American Chemical Society，2011，133(32)：12749-12757.

(責(zé)任編輯：田?軍)

Coupling Technologies of Biological Molecular Chains in Protein Force Spectroscopy Testing

Hu Xiaotang1, 2，Li Shuai1, 2，Hu Chunguang1, 2，He Chengzhi1, 2, 3，Gao Xiaoqing1, 2，Han Mengke1, 2，Ma Guoteng1, 2，Li Hongbin1, 2, 4，Hu Xiaodong1, 2

(1. State Key Laboratory of Precision Measuring Technology and Instruments(Tianjin University)，Tianjin 300072，China；2. Nanchang Institute for Microtechnology of Tianjin University，Tianjin 300072，China；3. Beijing Advanced Innovation Center for Soft Matter Science and Engineering(Beijing University of Chemical Technology)，Beijing 100029，China； 4. Department of Chemistry, University of British Columbia，Vancouver V6T 1Z4，Canada)

Protein force spectroscopy testing is one of the important components of the study of biology. The success of protein force spectroscopy testing depends on the following factors：the capability of force spectroscopy measure-ment at the molecular scale，namely piconewton-scale force resolution and nanometer-scale spatial resolution，and the protein sample preparation technique，which achieves effective measurement of protein samples at the molecular scale through the coupling of microscopic biomolecular chains with mesoscopic microspheres/probes/substrates. However，the coupling of protein samples is invisible and its coupling effect seriously affects the test efficiency. Therefore，the preparation method and coupling technology of protein samples are the key points in the measurement of single-molecule force spectroscopy. According to the various demands of three single-molecule force spectroscopy testing techniques on the samples，particularly the test requirement of multi-molecular chain-coupled samples，the authors introduce different methods to improve the connection efficiency between protein and DNA handles/micro-spheres/probes/glass slides/mica in optical tweezers，magnetic tweezers，and atomic force microscopy based on substrate，protein，and DNA modification，and discuss their advantages and disadvantages. The typical applications are summarized to provide a reference for the preparation of biological samples in related fields.

protein force spectroscopy；optical tweezer；magnetic tweezer；atomic force microscopy；coupling

the National Natural Science Foundation of China(No. 61223008)，the Key Program of the Natural Science Foundation of Tianjin，China (No. 15JCZDJC31600).

10.11784/tdxbz201807038

Q71

A

0493-2137(2019)02-0113-09

2018-07-27；

2018-09-07.

胡小唐（1952— ），男，教授，xthu@tju.edu.cn.

胡春光，cghu@tju.edu.cn．

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(61223008)；天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(15JCZDJC31600).