吳祖澤，汪?坤，李世崇，董曉娜，竇桂芳，葛志強(qiáng)，靳繼德

?

新蛭素和人IgG-Fc融合蛋白的表達(dá)純化和功能評價

吳祖澤1, 2，汪?坤1，李世崇2，董曉娜2，竇桂芳2，葛志強(qiáng)1，靳繼德2

(1. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2. 軍事科學(xué)院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

新蛭素(EH)具有很好的抗凝血效果，但由于半衰期短限制了其在臨床上的推廣和應(yīng)用．為延長EH的半衰期，制備人IgG-Fc和EH的融合蛋白，并對其活性和藥代動力學(xué)進(jìn)行初步研究．將合成的Fc-EH和Fc-L-EH融合基因克隆至表達(dá)載體pcDNAHC上，再將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞．蛋白A親和柱純化融合蛋白，用SDS-PAGE和Western Blot鑒定蛋白表達(dá)情況，質(zhì)譜法檢測蛋白的分子質(zhì)量和C端序列，體外凝塊法和大鼠頸靜脈血栓模型分別驗(yàn)證融合蛋白的體外抗凝活性和體內(nèi)抗栓效果，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫法檢測融合蛋白半衰期．結(jié)果表明，成功構(gòu)建了pcDNAHC-Fc-EH和pcDNAHC-Fc-L-EH兩個重組表達(dá)載體，融合蛋白Fc-EH和Fc-L-EH分子質(zhì)量分別為68476,u和70542,u，蛋白的C端序列正確，F(xiàn)c-EH和Fc-L-EH活性分別為256,ATU/mg和64,ATU/mg．大鼠頸靜脈血栓實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)c-EH具有抗血栓作用，體內(nèi)消除半衰期為39.4,h．融合蛋白Fc-EH能延長EH體內(nèi)半衰期，為融合蛋白的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)．

水蛭素；新蛭素；抗凝活性；半衰期；Fc融合蛋白

天然水蛭素(hirudin，HV)是水蛭唾液腺分泌的一種小分子蛋白質(zhì)，是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凝血酶天然特異抑制劑[1]，可直接抑制凝血酶活性且不需要抗凝血酶Ⅲ協(xié)同參與，不會誘發(fā)血小板和纖維蛋白的減少，有良好的抗凝溶栓效果[2-3]．但是水蛭素存在嚴(yán)重的出血副作用，限制了其在臨床上的推廣和應(yīng)用[4]．本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并表達(dá)了通過靶向血栓部位釋放抗凝活性的水蛭素衍生物[5]，它將凝血因子Ⅹa和Ⅺa特異性識別并切割的寡肽谷氨酸-脯氨酸-精氨酸(EPR)連接到了水蛭素氨基末端，該寡肽可以封閉水蛭素的抗凝活性，只有當(dāng)體內(nèi)的凝血系統(tǒng)被激活時，寡肽EPR被富集到凝血部位的凝血因子Ⅹa和Ⅺa識別并裂解掉，才能釋放出有活性的水蛭素，發(fā)揮靶向抗凝作用．通過這種設(shè)計(jì)可降低全身或系統(tǒng)性出血風(fēng)險(xiǎn)，將此水蛭素衍生物命名為新蛭素(neorudin，EH[6]). EH的分子質(zhì)量很小，只有7.3,ku，很容易被腎小球過濾排除出體外，所以半衰期很短，約1～2,h[7]，臨床上需多次給藥才能維持抗凝效果，因此，降低了患者用藥的耐受性和依從性．

免疫球蛋白G(IgG)是人體血液中含量最豐富的蛋白質(zhì)之一，體內(nèi)半衰期長達(dá)21,d，其半衰期與Fc片段密切有關(guān)[8]．將具有生物活性的功能蛋白分子與 Fc 片段融合，不僅可以延長目的蛋白的半衰期，還可以保留其生物學(xué)活性．本研究將EH、人IgG-Fc以兩種不同的方式進(jìn)行融合表達(dá)，一種是兩者直接融合，另一種是兩者之間引入甘氨酸絲氨酸(GS)組成的連接肽，合適的連接肽可以增加融合蛋白的柔性并增強(qiáng)其活性[9]．希望能夠獲得既能明顯延長EH半衰期、又不影響抗凝活性釋放的融合蛋白，為新型抗凝蛋白的研究奠定基礎(chǔ)．

1?材料與方法

1.1?材?料

Wistar大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物質(zhì)量合格證號：SCXK(京)2016-0006；胰蛋白胨和酵母提取物購自O(shè)XOID公司；蛋氨酸亞氨基代砜(MSX)和山羊抗人IgG-Fc(HRP)購自sigma公司；抗水蛭素抗體購自Abcam公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；Q5高保真DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、快速連接酶、限制性內(nèi)切酶Ⅰ、Ⅰ和FXa蛋白酶購自NEB公司；Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；CD CHO培養(yǎng)基、Anti-Clumping Agent購自Gibco公司；澳洲胎牛血清購自北京百靈克生物科技有限責(zé)任公司；生物反應(yīng)器購自賽多利斯公司；HiTrapTMrprotein A FF親和層析預(yù)裝柱購自GE公司；Fc-EH和Fc-L-EH融合基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，以pUC57-Fc-EH和pUC57-Fc-L-EH質(zhì)粒形式提供；表達(dá)載體pcDNAHC由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，CHO細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；人凝血酶和牛纖維蛋白原購自中國食品藥品檢定研究院；三氯化鐵購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；EH蛋白凍干品由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供；注射用低分子量肝素鈣(立邁清)購自中國人民解放軍307醫(yī)院；微孔板發(fā)光分析儀購自北京濱松光子技術(shù)股份有限公司；融合蛋白Fc-EH化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒購自北京福瑞潤康生物技術(shù)有限公司．

1.2?方?法

1.2.1?引物的設(shè)計(jì)與合成

實(shí)驗(yàn)用PCR引物序列如表1所示．

表1?PCR引物的序列

Tab.1?Sequence of PCR primers

注：下劃線序列是Ⅰ(GCTAGC)和Ⅰ(CTCGAG)引物的酶切位點(diǎn).

1.2.2?pcDNAHC-Fc-EH和pcDNAHC-Fc-L-EH重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)已知的融合基因設(shè)計(jì)引物Fc-EH-FP、Fc-L-EH-FP、Fc-EH-RP和Fc-L-EH-RP，分別以合成的pUC57-Fc-EH和pUC57-Fc-L-EH質(zhì)粒為模板，利用Q5高保真DNA聚合酶PCR擴(kuò)增目的基因片段．瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，切膠回收目的片段，將回收產(chǎn)物進(jìn)行TaqDNA聚合酶催化的PCR反應(yīng)，然后用快速連接酶將PCR產(chǎn)物與T載體相連接，轉(zhuǎn)化至Trans10感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并進(jìn)行酶切鑒定和測序．

用限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ、Ⅰ雙酶切含目的基因的T載體和表達(dá)載體pcDNAHC，將酶切得到的Fc-EH和Fc-L-EH片段克隆至表達(dá)載體上，得到重組質(zhì)粒(見圖1)．重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Trans10感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，進(jìn)行雙酶切鑒定并測序．

圖1?重組質(zhì)粒圖譜

1.2.3?重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞與混合克隆的篩選

根據(jù)invitrogen公司脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，將重組質(zhì)粒pcDNAHC-Fc-EH和pcDNAHC-Fc-L-EH轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24,h后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)至搖瓶中培養(yǎng)，用25,μmol/L的MSX加壓篩選，收集搖瓶中細(xì)胞培養(yǎng)上清，稀釋后用ELISA法檢測融合蛋白表達(dá)水平，選擇高表達(dá)混合克隆細(xì)胞．

1.2.4?Western Blot檢測融合蛋白表達(dá)

取高表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)上清，進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證．經(jīng)12%,的SDS-PAGE后，凝膠濕法轉(zhuǎn)膜(100,V，1.5,h)，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%,的BSA封閉40,min，TBST溶液洗膜3次，用山羊抗人IgG-Fc/HRP(1∶3,000稀釋)室溫孵育1,h，TBST溶液洗膜3次，滴加顯影液進(jìn)行顯影，凝膠成像儀進(jìn)行拍照.

1.2.5?融合蛋白的純化

篩選出來的混合克隆細(xì)胞經(jīng)生物反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，先用0.80,μm和0.45,μm的濾膜依次過濾進(jìn)行初步純化，再用蛋白A親和層析柱進(jìn)行進(jìn)一步純化．親和柱用5倍柱體積的pH 7.0、20,mmol/L的磷酸鹽緩沖液平衡，然后將濾過的細(xì)胞培養(yǎng)上清過柱子，用平衡緩沖液沖洗柱子至紫外吸收值到達(dá)基線，再用pH,3.0、0.1,mol/L的檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫，pH,9.0、0.1,mol/L的Tris-Hcl調(diào)節(jié)蛋白液pH值至7.0．

1.2.6?融合蛋白濃度和純度測定

用NanoDrop儀和Folin-酚法測純化的融合蛋白濃度，F(xiàn)olin-酚法參考2015版的《中國藥典》第三部；取融合蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，凝膠使用考馬斯亮藍(lán)染色后，進(jìn)行掃描拍照，再用Scion Image軟件分析融合蛋白純度．

1.2.7?融合蛋白分子質(zhì)量測定和C端測序

采用還原性SDS-PAGE和LC-MS(液相色譜-質(zhì)譜)聯(lián)用的方法測定融合蛋白的相對分子質(zhì)量．用胰蛋白酶處理融合蛋白Fc-EH和Fc-L-EH，質(zhì)譜法檢測融合蛋白的C端氨基酸序列．

1.2.8?融合蛋白體外抗凝活性檢測

取30,μL稀釋的融合蛋白與1,μL凝血因子Ⅹa混勻，37,℃裂解6,h；裂解的融合蛋白做倍比稀釋(根據(jù)形成凝塊決定最終稀釋倍數(shù))，取10,μL不同稀釋倍數(shù)的樣品，各加入20,μL、8,IU/mL凝血酶，輕輕混勻再加入2.5%,的纖維蛋白原20,μL，室溫靜置15,min，輕彈EP管壁，觀察凝塊形成情況．等體積的去離子水替代裂解的融合蛋白和凝血酶溶液作為空白對照；等體積的去離子水替代裂解的融合蛋白溶液作為陽性對照；未裂解的融合蛋白溶液替代裂解的融合蛋白溶液作為裂解前對照．融合蛋白的抗凝活?性＝凝血酶活性/未出現(xiàn)凝塊最低融合蛋白濃度＝(凝血酶活性單位×凝血酶體積)/(融合蛋白濃度÷稀釋倍數(shù)×樣品體積)．

1.2.9?Fc-EH融合蛋白體內(nèi)活性初步檢測

Wistar大鼠，雄性，體重200～250,g，隨機(jī)分為模型組、陽性對照組和不同劑量實(shí)驗(yàn)組，每組6只．陽性對照組分別尾靜脈注射低分子肝素鈣(劑量3,U/kg)和EH(劑量3,mg/kg)，實(shí)驗(yàn)組分別尾靜脈注射融合蛋白Fc-EH(融合蛋白劑量分別為4.5、13.5、27.0,mg/kg，換算成EH劑量分別為1、3、6,mg/kg).分離頸靜脈，靜脈下放置小片塑料薄膜(2,cm×1,cm)保護(hù)血管周圍組織，靜脈注射給藥15,min后，再用3,mL、50%,FeCl3溶液浸潤的無塵紙(1.0,cm×0.5,cm)包裹血管，造成血管內(nèi)皮損傷，誘導(dǎo)血栓形成．造模后0.5,h取血，3.8%,的枸櫞酸鈉抗凝，離心分離血漿測定凝血參數(shù)PT和APTT；2,h后剖開血管取出血栓，濾紙吸干凈血栓表面血液，稱量其濕重．

1.2.10?Fc-EH融合蛋白藥代動力學(xué)初步研究

取6只Wistar雄性大鼠，體重200～250,g，以13.5,mg/kg劑量單次尾靜脈注射融合蛋白Fc-EH．分別在給藥前和給藥后0.5,h、1,h、2,h、4,h、12,h、24,h、48,h、72,h、96,h、120,h和144,h取血，3.8%,的枸櫞酸鈉抗凝，離心分離血漿．利用雙抗體夾心法檢測血漿中融合蛋白Fc-EH含量，即用水蛭素抗體包被，加入待測樣品，再加山羊抗人IgG-Fc(HRP標(biāo)記)，最后加入化學(xué)發(fā)光底物后，用光子計(jì)數(shù)儀測定各孔的光子計(jì)數(shù)．采用WinNonlin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算藥代動力學(xué)參數(shù)．

全球領(lǐng)先的傳動與控制技術(shù)專家博世力士樂在2018年上海寶馬展上展出了多款應(yīng)用于行走機(jī)械行業(yè)的智能化和個性化產(chǎn)品，致力于幫助眾多中國本土客戶解決在企業(yè)發(fā)展和產(chǎn)品創(chuàng)新方面的諸多難題。

2?結(jié)?果

2.1?重組表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

用PCR擴(kuò)增融合基因，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析．結(jié)果顯示，擴(kuò)增的片段大小約為960,bp和1,000,bp，與融合基因Fc-EH和Fc-L-EH預(yù)期大小相一致；將融合基因克隆至T載體，用Ⅰ、Ⅰ雙酶切，酶切結(jié)果與預(yù)期一致，測序結(jié)果正確．

將測序正確的融合基因克隆至表達(dá)載體pcDNAHC上，用Ⅰ、Ⅰ雙酶切重組質(zhì)粒，酶切結(jié)果顯示大約在960,bp和1,000,bp位置有特異性條帶(見圖2)，與預(yù)期結(jié)果相一致；重組質(zhì)粒測序結(jié)果正確，說明沒有發(fā)生核苷酸序列突變，通過酶切和測序的結(jié)果，表明pcDNAHC-Fc-EH和pcDNAHC-Fc-L-EH質(zhì)粒構(gòu)建成功．

圖2?重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2.2?重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和融合蛋白檢測

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，MSX加壓篩選培養(yǎng)兩周后，轉(zhuǎn)染組有成簇的細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)生，擴(kuò)大培養(yǎng)后收集細(xì)胞上清，稀釋3,000倍后通過ELISA法檢測不同細(xì)胞培養(yǎng)上清中融合蛋白表達(dá)量(見表2)．

表2?融合蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

Tab.2?Result of expression of fusion protein

根據(jù)ELISA的結(jié)果，分別取細(xì)胞株A3和B2細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證，兩個高表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)上清在分子質(zhì)量35,ku左右產(chǎn)生特異性條帶(見圖3)，與融合蛋白預(yù)期分子質(zhì)量大小一致．

1—Fc-EH高表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)上清；2—Fc-L-EH高表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)上清

圖3?Western Blot鑒定細(xì)胞培養(yǎng)上清

Fig.3 Identification of cell culture supernatant using Western Blot

2.3?融合蛋白的純化及鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)蛋白A親和柱純化后進(jìn)行SDS-PAGE，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后得到4條清晰的目的蛋白條帶(見圖4)，第1和第2泳道為還原性SDS-PAGE，融合蛋白呈現(xiàn)為單體形式；第3和第4泳道為非還原性SDS-PAGE，融合蛋白呈現(xiàn)為二聚體形式．作為IgG抗體一部分的Fc片段含有二硫鏈，主要以二聚體的形式存在[10]．本實(shí)驗(yàn)表達(dá)的兩個Fc融合蛋白也主要是以二聚體的形式存在．電泳圖經(jīng)灰度分析得出融合蛋白Fc-EH和Fc-L-EH的純度分別為98.9%,和97.8%,．

M—蛋白marker；1—融合蛋白Fc-EH單體；2—融合蛋白Fc-L-EH單體；3—融合蛋白Fc-EH二聚體；4—融合蛋白Fc-L-EH二聚體

質(zhì)譜測得融合蛋白Fc-EH和Fc-L-EH的分子質(zhì)量分別是68,476,u和70,542,u(見圖5)，與融合蛋白二聚體的理論分子質(zhì)量大小相一致，進(jìn)一步證實(shí)融合蛋白以二聚體的形式存在．融合蛋白Fc-EH和Fc-L-EH的C端測序結(jié)果GNQCVTGEGTPKPESHN NGDFEEIPEEYLQ，與標(biāo)準(zhǔn)融合蛋白的C端序列比對相同．

圖5?融合蛋白質(zhì)譜分析

2.4?融合蛋白活性檢測

體外凝塊法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(見表3)，未經(jīng)FXa切割的融合蛋白沒有抗凝功能，但經(jīng)FXa裂解后的融合蛋白Fc-EH和Fc-L-EH均釋放出抗凝活性，融合蛋白Fc-EH活性為256,ATU/mg，F(xiàn)c-L-EH活性為64,ATU/mg．

表3?融合蛋白的抗凝活性

Tab.3?Anti-thrombin activity of fusion protein

注：“＋”有凝塊；“-”無凝塊；空白對照：30,μL蒸餾水＋20,μL纖維蛋白原；陽性對照：10,μL蒸餾水＋20,μL凝血酶＋20,μL纖維蛋白原；裂解前：10,μL未裂解的樣品＋20,μL凝血酶＋20,μL纖維蛋白原．

2.5?抗大鼠頸靜脈血栓實(shí)驗(yàn)結(jié)果

融合蛋白Fc-EH對大鼠靜脈凝血參數(shù)的影響結(jié)果顯示(見圖7)，與生理鹽水組比較，4.5mg/kg、13.5mg/kg、27.0mg/kg融合蛋白Fc-EH組的PT值均明顯延長．與低分子肝素鈣組比較，4.5mg/kg融合蛋白組和EH組的PT值有明顯差異(＜0.05，＜0.001)，13.5mg/kg、27.0mg/kg融合蛋白無明顯差異(＞0.05)．4.5mg/kg融合蛋白和EH組的APTT值與生理鹽水組無明顯差異(＞0.05)，13.5mg/kg、27.0mg/kg融合蛋白組明顯高于生理鹽水組(＜0.001，＜0.001)．低分子肝素鈣給藥組的APTT值明顯高于4.5mg/kg、13.5mg/kg、27.0mg/kg融合蛋白組．等摩爾劑量的Fc-EH對PT和APTT的影響大于EH(＜0.01，＜0.001)．

?*表示P＜0.05，***表示P＜0.001

?*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001

2.6?融合蛋白Fc-EH藥代動力學(xué)檢測

通過化學(xué)發(fā)光免疫法檢測大鼠給藥后不同采血時間點(diǎn)血漿中融合蛋白Fc-EH的含量(見圖8)，經(jīng)計(jì)算，大鼠靜脈注射13.5,mg/kg融合蛋白Fc-EH后藥代動力學(xué)參數(shù)，峰質(zhì)量濃度(max)為(32.0±3.9) μg/mL，藥-時曲線下面積(AUC0～144)為(1,294.9±104.6)(,h·μg)/mL，體內(nèi)消除半衰期1/2為(39.4±4.9)h．

圖8?大鼠靜脈注射Fc-EH后的平均藥-時曲線

3?討?論

為解決水蛭素出血問題，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了水蛭素的衍生物——新蛭素．通過體外的抗凝實(shí)驗(yàn)[11]、體內(nèi)的大鼠頸動脈血栓模型和后腔靜脈血栓模型實(shí)驗(yàn)[6]均證明了EH在有效抗血栓作用的情況下，出血副作用明顯降低．雖然EH有很好的抗栓效果，但其體內(nèi)半衰期較短，給臨床應(yīng)用帶來一定的不便，因此，需要對EH修飾或改良來延長其半衰期，提高藥物療效.

傳統(tǒng)上，增加重組蛋白半衰期的主要策略是通過與聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)來增加流體動力學(xué)體積，從而延長藥物在體內(nèi)的代謝時間[12-14]．但是偶聯(lián)PEG的方法存在很多問題，它與腎皮質(zhì)上皮細(xì)胞的空泡化有關(guān)，存在安全性問題，且PEG在體內(nèi)很難被降解，修飾后的蛋白再純化、檢測分析困難和價格高等因素限制了它的應(yīng)用[15]．

將藥物蛋白和IgG的Fc片段融合是解決藥物半衰期短的另一重要方法．Fc融合蛋白通過新生兒Fc受體(FcRn)介導(dǎo)的再循環(huán)過程可提高多肽或者小分子蛋白藥物的藥代動力學(xué)參數(shù)，這一技術(shù)得到了廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用[16-19]．截至目前為止，F(xiàn)c融合蛋白藥物共有37種，處于Ⅰ/Ⅱ期臨床階段的有23種，Ⅲ期臨床階段有3種，已經(jīng)批準(zhǔn)上市的有11種[20]．所以，利用Fc融合目的蛋白已發(fā)展為一種可靠的藥物研發(fā)手段，具有很大的市場前景．

Fc片段與EH的連接方式有兩種，一種是連接在EH的N端，另一種是連接在EH的C端，如果Fc片段連接到EH的C端時，當(dāng)體內(nèi)凝血系統(tǒng)激活時，融合蛋白被相應(yīng)的凝血因子識別并裂解掉寡肽EPR，只釋放出水蛭素的N端抗凝血酶活性，由于融合蛋白很難被腎小球過濾快速清除掉，這樣裂解掉EPR寡肽的融合蛋白會一直保留著抗凝活性，增加了患者的出血風(fēng)險(xiǎn)．為了避免這一出血風(fēng)險(xiǎn)，本研究將Fc片段連接到EH的N端，在體內(nèi)凝血系統(tǒng)未被激活時，可以較長時間存在于血液中．而當(dāng)體內(nèi)產(chǎn)生血栓時，融合蛋白即可被相應(yīng)的凝血因子識別并裂解掉Fc和寡肽EPR，釋放出完整的水蛭素，水蛭素跟凝血酶結(jié)合抑制其活性，發(fā)揮抑制血栓的作用．因此，這種設(shè)計(jì)可以在延長藥物半衰期的基礎(chǔ)上，既保留了EH的抗凝活性，又不增加出血風(fēng)險(xiǎn)．考慮到兩種蛋白直接融合可能會影響蛋白的構(gòu)型，從而會影響凝血因子對EPR的識別和切割作用．GS連接肽常用于融合蛋白功能域之間的連接，可以降低蛋白之間的空間位阻，提高蛋白的活性[21]．因此，本文設(shè)計(jì)了在EH和IgG-Fc蛋白之間增加GS連接肽的結(jié)構(gòu)，通過增加融合蛋白的柔性而規(guī)避其對EPR識別位點(diǎn)的?影響．

體外凝塊法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，融合蛋白的活性(Fc-EH為256,ATU/mg，F(xiàn)c-L-EH為64,ATU/mg)均較EH蛋白(512,ATU/mg)降低，說明融合蛋白的抗凝活性受到了連接Fc片段的干擾．而融合蛋白Fc-L-EH的活性受到干擾更為明顯，推測連接肽進(jìn)一步阻礙了凝血因子對融合蛋白EPR位點(diǎn)的識別與切割，結(jié)果沒有達(dá)到預(yù)期目的．此外，連接肽的組成、長度、疏水性、對蛋白酶的敏感性都會影響蛋白的活性，后續(xù)會進(jìn)一步設(shè)計(jì)和篩選最優(yōu)的連接肽，提高融合蛋白的活性．

動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Fc-EH融合蛋白可有效抑制大鼠靜脈血栓的形成，并呈劑量依賴性，在相同抗栓效果下，對凝血參數(shù)PT和APTT影響明顯低于低分子肝素．在相同摩爾給藥劑量下，F(xiàn)c-EH融合蛋白與EH抗栓效果相當(dāng)，但對凝血參數(shù)的影響較EH有所增加，可能與Fc-EH的體內(nèi)半衰期較長有關(guān)．

Fc-EH在大鼠體內(nèi)的半衰期長達(dá)39.4,h，而 EH在獼猴體內(nèi)半衰期經(jīng)ELISA法檢測為1.3,h，EH在大鼠體內(nèi)半衰期經(jīng)放射性同位素標(biāo)記法檢測為6.3,h．因此與EH相比，F(xiàn)c-EH在體內(nèi)的半衰期明顯延長，可較長時間地在體內(nèi)發(fā)揮抑制血栓形成的作用．同時由于Fc-EH發(fā)揮抗凝活性需要凝血因子對其識別切割釋放EH，因此Fc-EH半衰期的延長不會明顯增加藥物的出血副作用．Fc-EH融合蛋白的獲得，為開發(fā)出安全、特異性和長效的新型抗栓藥奠定基礎(chǔ)．

4?結(jié)?論

(1)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化合成了融合基因Fc-EH和Fc-L-EH，并成功構(gòu)建了兩個重組表達(dá)載體pcDNAHC-Fc-EH和pcDNAHC-Fc-L-EH，將構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)蛋白A親和柱純化，得到了融合蛋白Fc-EH和Fc-L-EH，純度分別為98.9%和97.8%.

(2)融合蛋白Fc-EH和Fc-L-EH經(jīng)FXa裂解后，凝塊法檢測融合蛋白Fc-EH和Fc-L-EH的活性分別為256ATU/mg和64ATU/mg．

(3)融合蛋白Fc-EH體內(nèi)藥效學(xué)結(jié)果顯示其具有較好的抗血栓活性，血栓濕重呈融合蛋白劑量依賴性降低；相同藥效的情況下，融合蛋白Fc-EH的出血風(fēng)險(xiǎn)較低分子肝素明顯降低．

(4)融合蛋白Fc-EH體內(nèi)藥代動力學(xué)結(jié)果顯示，其半衰期明顯延長，大約是EH的20倍，可較長時間在體內(nèi)發(fā)揮抗血栓作用．

(5)本研究成功構(gòu)建并表達(dá)了融合蛋白Fc-EH，該融合蛋白可以有效抑制血栓的形成，半衰期的延長沒有明顯增加出血副作用．這種新型長效融合蛋白為抗凝血藥物的研究提供了新的思路．

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(責(zé)任編輯：田?軍)

Expression，Purification and Functional Evaluation of Neorudin-Human IgG-Fc Fusion Protein

Wu Zuze1, 2，Wang Kun1，Li Shichong2，Dong Xiaona2，Dou Guifang2，Ge Zhiqiang1，Jin Jide2

(1．School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2．Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Science，Beijing 100850，China)

Neorudin(EH)has a good anticoagulant effect．However，the short half-life of EH limits its clinical popularization and application．To prolong the half-life of EH，fusion proteins of Fc segment of human IgG and EH were prepared and the anticoagulant activity and pharmacokinetics of the fusion proteins were studied．The fusion genes Fc-EH and Fc-L-EH were cloned into the expression vector pcDNAHC and expressed in CHO cells．The fusion proteins were purified by protein A affinity chromatography and identified by SDS-PAGE and Western Blot．The molecular mass and C-terminal amino acid sequences of the fusion proteins were detected using mass spectrometry．The anticoagulant activities of fusion proteinsandwere detected with clot methods and jugular vein thrombosis rat models，respectively．The half-life of the fusion protein was tested in rats by chemiluminescence immunoassay．The results of restriction enzyme reaction indicated that the two recombinant expression vectors pcDNAHC-Fc-EH and pcDNAHC-Fc-L-EH were constructed，and the molecular masses of two targeting proteins were measured 68,476,u and 70,542,u，respectively．The correct C-terminal amino acid sequences of the fusion proteins were obtained．The anticoagulant activity of the fusion protein Fc-EH is 256 ATU/mg，whereas that of Fc-L-EH is 64 ATU/mg．The results of jugular vein thrombosis rat models indicated that the fusion proteins of Fc-EH dose-dependently inhibited thrombosis．pharmacokinetic，studies showed that the elimination half-life of Fc-EH spanned 39.4,h．These results demonstrate that the Fc-EH fusion protein prolongs the half-life of EH，paving the way for the further studies of its anticoagulant effects.

hirudin(HV)；neorudin(EH)；anticoagulant activity；half-life；Fc fusion protein

10.11784/tdxbz201803084

Q819

A

0493-2137(2019)02-0136-07

2018-03-23；

2018-04-27.

吳祖澤（1935—??），男，院士，13910026365@163.com.

靳繼德，jinjide505@163.com.

國家科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2012ZX09102301-008).

the National Science and Technology Major Project of the Ministry of Science and Technology of China(No.2012ZX09102301-008).