程琳，孫榮凱，付茂輝，向桂玲

(1山東省立第三醫(yī)院，濟(jì)南250031；2解放軍第960醫(yī)院；3復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，是全球發(fā)病頻率最高的惡性腫瘤之一，侵襲性膀胱癌患者5年生存率低于60%[1]。長鏈非編碼RNA(LncRNAs)是內(nèi)源性非編碼的調(diào)節(jié)性RNA分子，在不同生物進(jìn)程中具有調(diào)節(jié)作用，如染色體失活、基因組印記與發(fā)育等[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，LncRNAs在包括膀胱癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中表達(dá)異常[3]。尿路上皮癌抗原1(UCA1)是第一個在膀胱癌中檢測到的致瘤性LncRNAs，位于19p13.12基因位點[4]。UCA1在多種腫瘤中高度表達(dá)，如乳腺癌、胰腺癌、胃癌和結(jié)直腸癌，UCA1高表達(dá)可能作為預(yù)測這些腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的分子標(biāo)記物[5]。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNAs與微小RNA(miRNA)可通過相互調(diào)控，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，其中miR-195可抑制胃癌、肺癌的生長和轉(zhuǎn)移，生物信息學(xué)軟件預(yù)測，miR-195可作用于UCA1基因[6]。但二者在膀胱癌中的表達(dá)相關(guān)性及與臨床病理特征的關(guān)系尚無報道。2013年6月～2015年1月，我們觀察了膀胱癌細(xì)胞及組織中UCA1和miR-195的表達(dá)變化，探討UCA1和miR-195表達(dá)與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器 人膀胱上皮永生化細(xì)胞株SV-HUC-1購自美國菌種保藏中心(ATCC)，膀胱癌T24細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；Star Spin Small RNA Kit(美國ABI公司)；LnRcute LncRNAs cDNA(美國ABI公司)；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國ABI公司)；實時熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司)；Nanodrop2000(美國Thermo Scientific公司)；熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞分組 SV-HUC-1、T24細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以SV-HUC-1作為對照組，以T24細(xì)胞為膀胱癌細(xì)胞組。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，TRIzol法提取細(xì)胞的總RNA用于后續(xù)實驗。

1.3 膀胱癌組織標(biāo)本及患者資料收集 選擇山東省立第三醫(yī)院2013年6月～2015年1月行根治性膀胱切除術(shù)的膀胱癌患者的組織標(biāo)本50例，其中男42例、女8例，年齡38～74(58.35±7.31)歲。所有患者臨床資料完整，術(shù)前均未接受放療、化療及免疫治療，術(shù)后病理診斷均為膀胱尿路上皮癌。另選取患者離癌組織5 cm以上、外觀無異樣的癌旁組織作為正常對照，病理診斷均為正常膀胱組織。術(shù)中取材后，立即置于液氮罐中速凍，隨后在-80 ℃保存。選取的組織標(biāo)本按WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級，其中G1級15例、G2級23例、G3級12例；按國際抗癌聯(lián)盟(UICC)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期，其中T1期21例、T2期12例、T3期13例、T4期4例；按是否出現(xiàn)腫瘤浸潤，其中非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)15例、肌層浸潤性膀胱癌(MIBC)35例；腫瘤初發(fā)10例，復(fù)發(fā)40例。采集標(biāo)本均經(jīng)患者知情同意及醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.4 UCA1、miR-195檢測 采用RT-PCR法。參照試劑盒說明書，分別采用TRIzol法和Star Spin Small RNA Kit提取總RNA和總小RNA。選用LnRcute LncRNAs cDNA試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；miRNA First Strand cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的small RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBR Green法檢測UCA1(GAPDH為內(nèi)參)和miR-195(U6為內(nèi)參)表達(dá)水平。UCA1、miR-195及內(nèi)參引物由上海生物工程股份有限公司合成。UCA1上游引物5′-CTCTCCATTGGGTTCACCATTC-3′，下游引物5′-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3′；miR-195上游引物5′-CTCAAGGCAACCTACCGAAAAG-3′，下游引物5′-TATCGGACCCATCACGGAGTGG-3′；GAPDH上游引物5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3′，下游引物5′-CCTGGAAGATGGTGATGCG-3′；U6上游引物5′-GATTAGAACCGTCGGTAACGGAA-3′，下游引物5′-AGCGATCTCGTTGGCCTTTCTACC-3′。UCA1基因反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。miR-195反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物特異性用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，基因表達(dá)差異采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。以UCA1或miR-141相對表達(dá)量 2-ΔΔCT≥1為陽性表達(dá)。

1.5 術(shù)后隨訪 術(shù)后對50例患者進(jìn)行隨訪至2018年1月。采用電話、訪視等方式進(jìn)行隨訪，第1年每3個月隨訪1次，隨后每6個月隨訪1次，隨訪內(nèi)容包括患者的生存狀態(tài)，其中已死亡患者包括死亡原因和死亡日期。所有患者均成功獲得隨訪，其間死亡患者以截尾數(shù)據(jù)統(tǒng)計，存活者均隨訪3年。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞中UCA1、miR-195表達(dá)比較 膀胱癌細(xì)胞組UCA1表達(dá)高于對照組、miR-195表達(dá)低于對照組(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組細(xì)胞中UCA1、miR-195表達(dá)比較

2.2 癌旁組織及膀胱癌組織中UCA1、miR-195表達(dá)比較 膀胱癌組織中UCA1表達(dá)高于癌旁正常組織，miR-195表達(dá)低于癌旁正常組織(P均<0.05)。見表2。

表2 癌旁組織及膀胱癌組織中UCA1、miR-195表達(dá)比較

2.3 膀胱癌組織中UCA1、miR-195表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 膀胱癌組織中，UCA1陽性38例，miR-195陽性7例。病理分級較高、臨床分期T3～T4者、腫瘤浸潤及復(fù)發(fā)者UCA1表達(dá)較高，病理分級低者、臨床分期T1～T2者、腫瘤未浸潤及初發(fā)者miR-195表達(dá)較高(P均<0.05)。UCA1、miR-195表達(dá)與患者年齡、性別無相關(guān)性(P均>0.05)。見表3。

表3 UCA1和miR-195在膀胱癌組織中的表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系(例)

2.4 膀胱癌組織中UCA1與miR-195 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析示，膀胱癌組織中UCA1與miR-195表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.673，P<0.05)。

2.5 膀胱癌患者生存情況及其影響因素的Cox回歸分析結(jié)果 隨訪3年，所有患者均成功獲得隨訪，50例患者中存活患者27例，死亡患者23例，平均生存率為54.00%。采用Kaplan-Meier法計算患者6個月、1年、3年生存率分別為64.41%、61.96%、54.16%?；颊呱媛逝c患者的性別、年齡、病理分級、腫瘤浸潤及發(fā)病特點之間無明顯相關(guān)性(P均>0.05)。臨床分期T1～T2患者生存率高于T3～T4期患者，UCA1陰性表達(dá)患者生存率高于陽性表達(dá)患者，miR-195陽性表達(dá)患者生存率高于陰性表達(dá)患者(P均<0.05)。Cox回歸模型示UCA1 陽性表達(dá)、miR-195陰性表達(dá)、臨床分期T3～T4及腫瘤轉(zhuǎn)移是影響膀胱癌患者預(yù)后的獨立危險因素(P均<0.05)。見表4。

表4 影響膀胱癌患者生存因素的Cox回歸分析

3 討論

膀胱癌是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率一直居高不下。膀胱癌患者死亡的主要原因是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。當(dāng)前，膀胱癌的治療以手術(shù)治療為主，但膀胱癌的多中心起源特性，使其具有易耐藥、易侵襲、易復(fù)發(fā)等特點，故目前對膀胱癌的研究主要集中在尋找從源頭調(diào)控膀胱癌生物學(xué)特性的有效靶點[7]。膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展受多因素影響，如DNA突變、蛋白質(zhì)異常，RNA異常也影響著膀胱癌的進(jìn)展。LncRNAs是一類非編碼RNA，廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，隨著對腫瘤發(fā)病機制研究的深入，國內(nèi)外學(xué)者意識到LncRNAs在多種腫瘤中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。LncRNAs對腫瘤的調(diào)控作用主要是通過影響細(xì)胞表觀修飾、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及RNA編輯等方式[8]。越來越多的報道顯示LncRNAs表達(dá)失調(diào)與包括膀胱癌在內(nèi)的多種癌癥的病理機制密切相關(guān)，故LncRNAs未來有望成為腫瘤臨床診斷和治療的分子靶標(biāo)[9]。

UCA1是膀胱癌中具有特異性和敏感性的致瘤LncRNAs，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，其高表達(dá)也與多種癌癥的侵襲有關(guān)。劉詠松等[10]研究表明，膀胱癌細(xì)胞系中UCA1表達(dá)水平高于非膀胱癌細(xì)胞系，且膀胱癌組織中UCA1表達(dá)水平亦高于正常癌旁組織。Liu等[11]研究表明，膀胱癌組織中UCA1表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織，呈特異性表達(dá)。Milowich等[12]報告顯示UCA1的表達(dá)率越高，腫瘤病理分級越高或患者預(yù)后越差，UCA1促進(jìn)膀胱癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，UCA1在膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于其在非膀胱癌細(xì)胞系的表達(dá)，膀胱癌組織中UCA1表達(dá)高于癌旁正常組織，提示UCA1的陽性表達(dá)與膀胱癌密切相關(guān)。為進(jìn)一步探究UCA1與膀胱癌的聯(lián)系，我們還對UCA1表達(dá)與膀胱癌患者的臨床參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示UCA1表達(dá)與病理分級、臨床分期、腫瘤浸潤及發(fā)病特點顯著相關(guān)，隨著腫瘤惡性程度增高而增高。進(jìn)一步分析顯示UCA1陽性表達(dá)患者的生存率低于陰性表達(dá)患者的生存率，提示UCA1陽性表達(dá)與膀胱癌患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)，推測UCA1可作為膀胱癌診斷及預(yù)測患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。

近年來，對miRNA在腫瘤中的調(diào)控機制研究的較為廣泛，其參與了腫瘤多種生理病理過程，特別是在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。miRNA依據(jù)靶基因的不同，從而發(fā)揮不同的作用，既可促進(jìn)癌癥的進(jìn)展也可抑制癌癥的進(jìn)展[13]。大量研究表明，miR-195在腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，且在多種癌癥中抑制腫瘤細(xì)胞生長、遷移和侵襲[14]。Zhang等[15]研究顯示，miR-195作為一個抑癌基因，可抑制非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，miR-195在膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平低于其在非膀胱癌細(xì)胞系的表達(dá)，膀胱癌組織中miR-195表達(dá)低于癌旁正常組織，提示miR-195的陰性表達(dá)與膀胱癌發(fā)生密切相關(guān)。為進(jìn)一步探究miR-195與膀胱癌的聯(lián)系，我們也對miR-195表達(dá)與膀胱癌患者的臨床參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示miR-195表達(dá)與臨床分期、腫瘤浸潤及發(fā)病特點顯著相關(guān)，隨著腫瘤惡性程度增高而降低；進(jìn)一步分析顯示miR-195陽性表達(dá)患者生存率顯著低于陰性表達(dá)患者的生存率，提示miR-195陰性表達(dá)與膀胱癌患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)，推測miR-195可能調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲，可作為判斷膀胱癌患者預(yù)后的新指標(biāo)。

LncRNAs可以發(fā)揮miRNA“海綿”作用，與內(nèi)源性RNA競爭，影響miRNA的調(diào)控作用。此外，LncRNAs可作為miRNA的前體直接影響miRNA的生物學(xué)功能，兩者相互作用影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[16]。Cai等[17]報道顯示，通過沉默LncRNAs-TUG1可靶向上調(diào)miR-144表達(dá)，提高膠質(zhì)細(xì)胞瘤血-腫瘤屏障的滲透性，增強抗腫瘤藥物的利用率。本課題組前期研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-195可作用于UCA1基因，推測UCA1基因能夠與miR-195靶點結(jié)合，調(diào)控miR-195的表達(dá)[6]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中UCA1與miR-195表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示高表達(dá)的UCA1基因可能通過抑制miR-195表達(dá)從而調(diào)控膀胱癌的進(jìn)程，二者在判斷膀胱癌預(yù)后中發(fā)揮著更重要的作用，但具體作用機制有待更進(jìn)一步的研究。

綜上所述，膀胱癌細(xì)胞及組織中UCA1表達(dá)增高、miR-195表達(dá)降低，UCA1表達(dá)增高、miR-195表達(dá)降低均與膀胱癌患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)，UCA1、miR-195對預(yù)測惡性腫瘤的生長、侵襲及預(yù)后發(fā)揮著重要的作用，聯(lián)合檢測UCA1與miR-195表達(dá)有望成為預(yù)測膀胱癌患者預(yù)后的分子標(biāo)記物，為膀胱癌靶向治療提供新的思路。